羅騰飛，胡文勝

(浙江省杭州市婦幼保健院產(chǎn)科 310008)

膽汁酸由膽固醇代謝產(chǎn)生，根據(jù)合成途徑，可以分為由膽固醇為原料直接合成的初級(jí)膽汁酸和代謝產(chǎn)生的次級(jí)膽汁酸[1]。膽汁酸是膽汁的重要組成成分，是人體脂肪代謝的必須物質(zhì)[2]。膽汁酸不僅能夠調(diào)節(jié)葡萄糖和脂代謝，還能與腸道菌群相互作用，具有重要的臨床意義[3]。不同的膽汁酸亞型在臨床上具有不同的診斷意義，因此檢測(cè)每一種亞型的膽汁酸在體內(nèi)水平而非簡(jiǎn)單地定量測(cè)量總膽汁酸水平，對(duì)于肝膽和腸道疾病的篩查、診斷和鑒別診斷具有重要意義[4]。

目前臨床上主要開(kāi)展膽汁酸的檢測(cè)方法包括氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-9]，但是目前對(duì)于檢測(cè)人體血清中膽汁酸亞型的研究相對(duì)較少，方法通量較低，也缺乏健康人參考范圍。本文旨在建立一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析膽汁酸亞型的快速方法，并且初步嘗試建立了健康人血清中15種膽汁酸的參考范圍，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇24例體檢健康志愿者(其中男17例，女7例)為研究對(duì)象，年齡20～45歲。于上午10：00-11：00空腹采集靜脈血，室溫放置0.5 h，3 500 r/min離心5 min，分離血清后于-80 ℃保存。

1.2儀器與試劑 Waters Xevo TQD IVD串聯(lián)質(zhì)譜；Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀；Masslynx 4.1工作站(美國(guó)Waters公司)；真空離心濃縮儀(湖南赫西儀器公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀公司)；BT125D電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒公司)；旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司)；超純水機(jī)(PALL)。甘氨石膽酸(GLCA)標(biāo)準(zhǔn)品(Toronto Research Chemicals公司)；14種膽汁酸[膽酸(CA)、石膽酸(LCA)、脫氧膽酸(DCA)、熊脫氧膽酸(UDCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)、?；悄懰?TCA)、甘氨膽酸(GCA)、牛磺石膽酸(TLCA)、牛磺脫氧膽酸(TDCA)、牛磺熊脫氧膽酸(TUDCA)、?；蛆Z脫氧膽酸(TCDCA)、甘氨脫氧膽酸(GDCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)]標(biāo)準(zhǔn)品及同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)氘代膽酸(d4-CA)、氘代脫氧膽酸(d4-DCA)、氘代熊脫氧膽酸(d4-UDCA)(Sigma Aldrich公司)；色譜純乙腈和色譜純甲醇(德國(guó)Merck公司)；色譜級(jí)甲酸(上海阿拉丁公司)。

1.3方法

1.3.1血清標(biāo)本處理 移取100 μL血清于1.5 mL離心管，加入300 μL低溫保存的含內(nèi)標(biāo)乙腈溶液，靜置1 min后旋渦振蕩5 min，在4 ℃下高速(11 000 r/min) 離心5 min，吸取上清液300 μL，低溫濃縮至接近干燥，100 μL的乙腈與水的體積比為30∶70，復(fù)溶；在4 ℃下高速(11 000 r/min)離心5 min，取上清液于96孔板用于LC-MS/MS上樣分析。

1.3.2色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈與甲醇(體積比為3∶1)的溶液；流速為0.4 mL/min；柱溫為45 ℃。梯度洗脫程序：0～2 min，35%～43%，B；2.0～3.5 min，43%～46%，B；3.5～5.0 min，46%～59%，B；5.0～7.0 min，59%，B；7.0～8.7 min，59%～66%，B；8.7～10.7 min，66%～98%，B；10.7～11.3 min，35%，B。離子源：電噴霧離子源(ESI)。掃描方式：負(fù)離子掃描。檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。毛細(xì)管電壓：3.0 kV。離子源溫度：150 ℃。脫溶劑氣溫度：400 ℃。脫溶劑氣流速：800 L/h。錐孔氣流速：50 L/h。用時(shí)間分段來(lái)提高待測(cè)物響應(yīng)值，15種膽汁酸質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 15種膽汁酸質(zhì)譜參數(shù)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Masslynx軟件分析LC-MS/MS結(jié)果；數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)出后，用Microsoft Excel 2017軟件分析15種膽汁酸水平；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示[M(P25,P75)]，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1方法學(xué)性能評(píng)價(jià)

2.1.1專屬性 分別取6份不同健康人的空白血清、標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，按“1.3.1血清標(biāo)本處理”要求操作，在LC-MS/MS條件下對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。在選用條件下，血清中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，專屬性良好，在上述分析條件下，15種膽汁酸在各個(gè)離子通道中分離良好。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍 將倍比稀釋的膽汁酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液取100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液300 μL，按“1.3.1血清標(biāo)本處理”項(xiàng)下處理并測(cè)定。以待測(cè)物濃度X為橫坐標(biāo)，相對(duì)響應(yīng)值Y(待測(cè)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值之比)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。建立15種膽汁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。其中CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA 質(zhì)量濃度為1.0～2 000.0 nmol/L，GCA、GDCA、TCA、TCDCA質(zhì)量濃度為10.0～2 000.0 nmol/L，其余物質(zhì)質(zhì)量濃度為10.0～6 000.0 nmol/L。15種膽汁酸在其范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r2均大于0.993。

2.1.3定量限 按照“1.3.1血清標(biāo)本處理”平行配制、處理5份血清標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)樣品，并進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得15種膽汁酸實(shí)測(cè)濃度，CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA的定量限為1.0 nmol/L，其余物質(zhì)定量限為10.0 nmol/L。

2.1.4提取回收率和精密度試驗(yàn) 向血清中分別添加低、中、高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA的3個(gè)加標(biāo)水平分別為3.0、1 000.0和1 500.0 nmol/L；GCA、GDCA、TCA、TCDCA其余物質(zhì)的3個(gè)加標(biāo)水平分別為30.0、3 000.0和4 500.0 nmol/L；其余每個(gè)膽汁酸加標(biāo)水平分別為30.0、1 000.0和1 500.0 nmol/L，按照“1.3.1血清標(biāo)本處理”項(xiàng)方法處理標(biāo)本，每個(gè)添加濃度平行測(cè)定6次，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)樣品結(jié)果計(jì)算本法的回收率和精密度，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<7.8%，平均回收率均為97.1%～108.3%。測(cè)定結(jié)果表明，血清樣品分析的回收率和精密度良好?？梢?jiàn)本試驗(yàn)所建立的LC-MS/MS法測(cè)定血清中15種膽汁酸的回收率和精密度符合生物樣品測(cè)定要求。

2.1.5穩(wěn)定性 膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液放置于進(jìn)樣器中，測(cè)定12 h內(nèi)膽汁酸濃度，得到膽汁酸對(duì)照品溶液穩(wěn)定性；將含有一定膽汁酸的血清樣品按“1.3.1血清標(biāo)本處理”項(xiàng)下處理并測(cè)定12 h內(nèi)后膽汁酸濃度，得到處理后放置穩(wěn)定性；將同一樣品放置在室溫，測(cè)定24 h內(nèi)膽汁酸的濃度，得到室溫放置穩(wěn)定性；將血清樣標(biāo)本放入-20 ℃冰箱中，第2天拿出復(fù)融，如此反復(fù)3次，按“1.3.1血清標(biāo)本處理”項(xiàng)下處理并測(cè)定，得到反復(fù)凍融穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果顯示相對(duì)偏差均小于15%，膽汁酸濃度均未出現(xiàn)明顯變化，說(shuō)明該試驗(yàn)方法穩(wěn)定性良好。

2.2血清標(biāo)本的測(cè)定 收集24例健康人的血清樣品，用本法測(cè)定其中膽汁酸濃度。結(jié)果顯示，健康人的膽汁酸以甘氨酸結(jié)合型(GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA)為主。游離型膽汁酸和?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸濃度相對(duì)較低。男性血清中DCA濃度顯著高于女性，男性血清中GUDCA濃度顯著低于女性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余膽汁酸差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表2 15種膽汁酸日內(nèi)和日間的回收率和精密度(%)

表3 健康男性和健康女性血清中膽汁酸濃度比較[nmol/L，M(P25,P75)]

性別nGCAGCDCAGDCAGLCAGUDCA男17242.6(158.2,398.4) 1798.6(1299.5,2973.4) 481.7(226.4,735.7)24.5(12.0,38.4)221.8(141.6,327.1) 女7333.8(148.3,470.9) 2795.6(1342.6,3144.7) 417.7(279.8.727.7) 13.6(9.3,27.7) 267.1(149.5,547.8)

性別nTCDCATDCATLCATUDCATCA男17112.9(52.0,212.7) 37.2(17.8,67.8) 4.6(3.5,5.5) 4.3(2.3,7.0) 22.3(11.3,40.0)女7117.8(71.0,208.0) 36.2(17.4,82.8) 2.1(1.6,6.9) 2.9(17.4,82.8) 21.5(17.3,30.6)

3 討 論

膽汁酸是膽固醇經(jīng)肝臟組織代謝的最終產(chǎn)物，是膽汁中的主要成分，膽汁酸的檢測(cè)具有重要的臨床意義。血液中膽汁酸濃度的增加程度提示患者可能患有不同種類的肝膽疾病。目前臨床常規(guī)檢測(cè)方法均只能檢測(cè)總膽汁酸的濃度變化，不能定性、定量鑒別不同組分的膽汁酸代謝物譜的變化；血清膽汁酸譜分析可提供膽汁酸腸肝循環(huán)是否正常的一項(xiàng)非常重要的信息；在肝臟病變?cè)缙?，血清中的總膽汁酸不?huì)發(fā)生明顯改變，而血清中各種亞型膽汁酸濃度將產(chǎn)生相應(yīng)的變化，因此，鑒別并測(cè)定膽汁酸代謝物譜有助于對(duì)肝病的早期診斷。

由于15種膽汁酸極性分布范圍很廣，試驗(yàn)采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18、Waters ACQUITY UPLC HSS T3、Thermo Hypersil gold AQ分離柱。試驗(yàn)表明，BEH C18對(duì)15種膽汁酸分離效果最好。本試驗(yàn)嘗試使用甲醇-水作為流動(dòng)相，樣品峰洗脫能力較差；使用乙腈-水作為流動(dòng)相，乙腈洗脫能力較強(qiáng)導(dǎo)致同分異構(gòu)體分離效果較差；將有機(jī)相調(diào)整為甲醇與乙腈的混合組分，有機(jī)相中甲醇與乙腈的比例為1∶3時(shí)得到的峰形和響應(yīng)值較理想。水相中加入甲酸配制成0.1%甲酸水溶液使目標(biāo)物響應(yīng)增大，提高靈敏度。本試驗(yàn)中血清標(biāo)本采用蛋白沉淀法，經(jīng)過(guò)乙腈處理后，得到良好的效果。整個(gè)操作方便快速，簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，降低了檢測(cè)成本，又提高了檢測(cè)效率。

本文建立了一種靈敏度高、簡(jiǎn)便快速和選擇性好的LC-MS/MS分析法用于測(cè)定人血清中膽汁酸的濃度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，15種膽汁酸在各個(gè)離子通道中分離良好，在1.0～6 000.0 nmol/L線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r2>0.993；目標(biāo)物的定量限為1.0～10.0 nmol/L；平均回收率在97.1%～108.3%，日內(nèi)、日間RSD均小于7.8%，符合生物樣品測(cè)定要求；膽汁酸對(duì)照樣品穩(wěn)定性、血清樣品處理后放置穩(wěn)定性、樣品室溫放置穩(wěn)定性、樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性的結(jié)果顯示相對(duì)偏差均小于15%，膽汁酸濃度均未出現(xiàn)偏差。說(shuō)明該分析方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可以達(dá)到較低的定量限，進(jìn)樣量少，可延長(zhǎng)色譜柱的壽命，而且用血量少，分析時(shí)間短，流動(dòng)相使用少。在對(duì)健康人血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)健康人的膽汁酸以甘氨酸結(jié)合型為主，游離型膽汁酸次之，而?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸濃度最低。?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸的離子化程度較高，甘氨酸結(jié)合型離子化程度中等，而游離膽汁酸較低。膽汁酸鹽極性越差，越容易與未吸收的纖維素或細(xì)菌結(jié)合，也越容易通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散被吸收，因此在人體中的膽汁酸以甘氨酸結(jié)合型為主。甘氨酸結(jié)合型膽汁酸濃度增加提示糖尿病和妊娠期有膽汁淤積癥風(fēng)險(xiǎn)，?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸濃度增加提示有膽汁淤積性肝損傷[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，男性血清中DCA濃度顯著高于女性，GUDCA濃度顯著低于女性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣可以觀察到，膽汁酸在健康者體內(nèi)的變化水平較大，需要更多的臨床樣本數(shù)據(jù)，從而建立人體內(nèi)合理的膽汁酸血清參考范圍；而未來(lái)進(jìn)一步通過(guò)對(duì)不同臨床疾病樣本的檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確評(píng)估不同膽汁酸亞型對(duì)臨床疾病的診斷價(jià)值。

綜上所述，本研究建立的檢測(cè)方法可應(yīng)用于人體血清中15種膽汁酸亞型濃度的檢測(cè)，對(duì)于未來(lái)臨床診斷不同的肝膽疾病有較大的應(yīng)用價(jià)值。