葛燕梅，樊蘇逸，毛 源，袁 杭，曹 鵬，張厚智

(南京金域醫(yī)學檢驗所，南京 210042)

CYP2C19基因具有遺傳多態(tài)性，其編碼的S-美芬妥英羥化酶是細胞色素氧化酶P450的主要成分之一，參與華法林、氯吡格雷、地西泮、普萘洛爾、奧美拉挫等臨床常用藥物代謝[1]，該種酶類活性存在顯著的個體差異，表現(xiàn)為血藥濃度的個體差異。臨床常用的CYP2C19基因分型的檢測方法為等位基因特異聚合酶鏈反應(PCR)，限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)，DNA測序和基因芯片技術等[2-6]。但是這些方法操作繁瑣，費時費力，難以滿足臨床實驗室常規(guī)檢測需求。PCR具有高度的靈敏度和特異度，與其他CYP2C19基因分型檢測方法相比，操作簡單，結果易于判斷，因此便于臨床常規(guī)檢測。本研究通過與測序法結果比較，對熒光PCR檢測CYP2C19基因分型分析性能進行驗證評估，為使用熒光PCR檢測CYP2C19基因分型的實驗室提供參考。

1 資料與方法

1.1標本來源 江蘇地區(qū)送往金域檢驗所進行CYP2C19基因分型檢測的標本。

1.2儀器和試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀，恒溫水浴箱，5145R高速冷凍離心機。血液核酸提取純化試劑盒和人CYP2C19基因分型檢測試劑盒均由蘇州曠遠生物分子技術有限公司提供。

1.3方法 依據(jù)《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》對熒光PCR檢測CYP2C19基因分型進行準確性、精密度、靈敏度、特異度、臨界值和最低檢測限等的相關性能驗證

1.3.1準確性評估 使用患者送檢的新鮮血液標本20例，使用的比對方法為測序法。被評價方法和比對方法在1～5 d內同時檢測標本，然后觀察兩種方法的符合情況(結果一致性)。

1.3.2精密度 定性檢測項目以陰陽性作為判斷依據(jù)，檢測結果通常以Ct值形式顯示。本研究使用在不同條件下的Ct的數(shù)值的一致程度作為精密度的評價標準，要求變異度(CV)≤10.00%符合要求。

1.3.3診斷靈敏度 診斷靈敏度采用百分數(shù)表達，以公式100×真陽性值數(shù)(TP)/[TP+假陰性值數(shù)(FN)]進行計算。取10份已知管結論真陽性的標本(從上述已測序標本中挑選)，用被評價方法檢測，計算檢測出來陽性的標本占的比例。

1.3.4診斷特異度 診斷特異度采用百分數(shù)表達，以100×TN/(TN+FP)進行計算。取10份已知管結論真陰性的標本(從上述已測序標本中挑選)，用被評價方法檢測，計算檢測出來陰性的標本占的比例。

1.3.6最低檢測限 取適量濃度標本，經(jīng)稀釋后測量被測物濃度在10 ng/μL左右，上機檢測，重復2～3次。要求能正常判斷出檢測結果即為驗證通過。

2 結 果

2.1熒光PCR檢測CY92C19基因分型結果 2G反應體系：△Ct≤5，G陽性；△Ct>5或Ct(FAM)“Undetermined”，G陰性。2A反應體系：△Ct≤5，A陽性；△Ct>5或Ct(FAM)“Undetermined”，A陰性。3G反應體系：△Ct≤7，G陽性；△Ct>7或Ct(FAM)“Undetermined”，G陰性。3A反應體系：△Ct≤7，A陽性；△Ct>7或Ct(FAM)“Undetermined”，A陰性。

2.2熒光PCR和測序法同時檢測標本結果符合率 兩種方法同時檢測20例標本，檢測結果符合率為100%，符合要求。

2.3精密度驗證結果 PCR檢測CYP2C19基因分型精密度驗證結果見表1，2G反應體系FAM和ROX熒光通道結果CV分別為2.77%、2.06%，2A反應體系FAM和ROX熒光通道結果CV分別為3.36%、2.78%，3G反應體系FAM和ROX熒光通道結果CV分別為2.49%、1.17%，3A反應體系FAM和ROX熒光通道結果CV分別為1.27%、1.45%，均小于10%，符合要求。

表1 PCR檢測CYP2C19基因分型精密度驗證結果

2.4診斷靈敏度和特異度驗證結果 PCR檢測CYP2C19基因分型，驗證的靈敏度和特異度均為100%，符合要求。

2.5臨界值驗證結果 PCR熒光法檢測CYP2C19基因分型設定的cut off值：2G和2A反應體系△Ct為5，3G和3A反應體系△Ct為7。驗證的cut off值2G反應體系△Ct為0.95，2A反應體系△Ct為0.84，均小于設定的cut off值5；驗證的cut off值3G反應體系△Ct為1.47，3A反應體系△Ct為1.43，均小于設定的cut off值7，驗證通過，符合要求，見表2。

表2 PCR檢測CYP2C19基因分型臨界值驗證結果

2.6最低檢測限驗證結果 PCR熒光法檢測CYP2C19基因分型最低檢測下限要求DNA濃度不低于10 ng/μL。取提取好的DNA模板(濃度為50 ng/μL)稀釋濃度至10 ng/μL，重復檢測3次，檢測結果與稀釋前一致，驗證通過。

3 討 論

CYP2C19*2(rs244285)基因在5號外顯子681位點的G→A單堿基突變可產(chǎn)生一個異常剪接位點；CYP2C19*3(rs4986893)基因在4號外顯子636位點的G→A單堿基突變可提前產(chǎn)生一個終止密碼子，從而導致表達非功能性蛋白。這2個基因突變所表達的CYP酶將導致形成氯吡格雷等藥物活性代謝物的量減少。攜帶CYP2C19*2(c.681G>A)或CYP2C19*3(c.636G>A)多態(tài)性基因的患者表型為慢代謝型，基因型表型為純合子CYP2C19*2/*2或*3/*3或雜合子*2/*3。這類人群代謝藥物緩慢，易導致藥物不良反應的產(chǎn)生。

熒光PCR檢測CYP2C19基因分型，操作簡單，結果易于判斷，因此便于臨床常規(guī)檢測使用。臨床實驗室在使用PCR時，需要充分了解其方法學性能，而且需采取嚴格的室內質量控制措施才能確保實驗結果的準確。ISO15189和CAP認可體系明確要求實驗室在開展新的檢測項目前需進行方法學分析性能驗證。因此，方法學性能驗證是實驗室開展PCR項目前必須要進行的工作[7]。

有兩類突變可引起CYP2C19基因多態(tài)性：一類是(如CYP2C19*2、*3、*4、*5、*7、*8等)可降低酶活性位點的突變[8-9]；另一類是可以增強酶活性的突變，目前僅發(fā)現(xiàn)CYP2C19*17位點突變。黃杰等[10]針對CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多態(tài)性位點設計引物和探針，建立檢測CYP2C19基因多態(tài)性的PCR-熒光探針法，評價了準確性、靈敏度和特異度。劉秀卿等[1]自建CYP2C19基因多態(tài)性熒光定量PCR，主要評價了準確性、靈敏度和重復性。以往學者在研究檢測CYP2C19基因多態(tài)性時，多為針對CYP2C19基因特定位點設計引物和探針，自建相應PCR檢測CYP2C19基因分型并進行相關性能評價。

本研究使用熒光PCR檢測CYP2C19基因分型使用的是商品化的試劑盒，評價了準確性、重復性、靈敏度和特異度，并且對試劑盒給出的臨界值和檢測限進行了驗證，對于該方法的性能驗證程序評價比較全面。準確性使用臨床標本進行檢測與測序法結果進行比較，評估符合率，兩種方法檢測結果的符合率為100%。由于該項目尚未參加室間質評，也未與其他實驗室進行結果比對，所以準確性可以進一步進行評價。本研究對熒光PCR檢測CYP2C19基因分型性能驗證程序進行較全面評估，為使用熒光PCR檢測CYP2C19基因分型的實驗室提供了一些參考。