朱朝陽(yáng)，董 青，董言斌，蘇保寧△

(1.江蘇省連云港市東方醫(yī)院兒科 222000；2.江蘇省連云港市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì) 222000；3.江蘇省連云港市東方醫(yī)院臨床研究與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 222000)

支氣管炎是兒童常見的下呼吸道疾病之一。由于兒童特殊的生理病理特點(diǎn)，支氣管炎發(fā)作時(shí)常伴有喘息，喘息次數(shù)的增加會(huì)導(dǎo)致哮喘發(fā)作傾向的增加。支氣管炎伴有喘息兒童部分最終轉(zhuǎn)變?yōu)橄瓋和臋C(jī)制仍然不清楚[1]。甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)是先天性免疫的重要成分，其血清水平受個(gè)體基因型的影響，MBL降低可以導(dǎo)致多種疾病[2]，尤其與感染性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。白細(xì)胞介素(IL)-17作為新型促炎細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)某些趨化因子產(chǎn)生，如IL-6、IL-8、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等，可有效介導(dǎo)組織炎性反應(yīng)[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)的多態(tài)性、血清MBL、IL-17水平的變化，探討其在支氣管炎伴有喘息兒童發(fā)作中的重要作用和臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取連云港市東方醫(yī)院2016年1月至2017年5月診斷為支氣管炎伴有喘息癥狀的住院兒童，按既往喘息次數(shù)進(jìn)行分組，既往喘息1次(喘1組)：共30例，其中男16例，女14例；年齡1歲4個(gè)月至3歲6個(gè)月，平均月齡(19.8±5.8)個(gè)月；既往喘息2次(喘2組)：共30例，其中男17例，女13例；年齡1歲6個(gè)月至3歲7個(gè)月，平均月齡(21.3±5.9)個(gè)月；健康對(duì)照組：隨機(jī)選取30例同期健康兒童，其中男15例，女15例，年齡1歲6個(gè)月至4歲8個(gè)月，平均月齡(26.1±8.4)個(gè)月。3組研究對(duì)象的一般臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：參考《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第8版)》中支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。(1)發(fā)病大多有上呼吸道感染癥狀，也可突然出現(xiàn)頻繁而較深的干咳，以后漸有支氣管分泌物；(2)在胸部可聞及干濕啰音，以不固定的干啰音為主，可限于一側(cè)；(3)癥狀輕者無(wú)明顯病容，重者發(fā)熱38～39 ℃，偶爾達(dá)40 ℃，多2～3 d退熱；(4)咳嗽一般延續(xù)7～10 d，有時(shí)遷延2～3周，或反復(fù)發(fā)作。同時(shí)，支氣管炎伴有喘息發(fā)作參考《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第7版)》中喘息性支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)年齡≥1歲且年齡≤5歲，男女不限，喘息呈反復(fù)發(fā)作，每年少于2次；(2)繼發(fā)上呼吸道感染后，發(fā)作時(shí)雙肺聞及呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長(zhǎng)；(3)經(jīng)治療5～7 d后喘息癥狀明顯減輕；(4)部分病例反復(fù)發(fā)作與感染有關(guān)；(5)近期預(yù)后大多良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<1歲或年齡>5歲；(2)結(jié)核、支氣管炎異物等引起喘息發(fā)作的疾??；(3)發(fā)作次數(shù)大于3次/年。

1.3儀器與試劑 迷你離心機(jī)MN100，臺(tái)式低速離心機(jī)scilogex-D1008，電子天平METTLER A1104，-80 ℃超低溫冰箱Thermo-705，電泳儀MP-300V，凝膠成像分析儀Tanon-2500，梯度實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) K960,超微量分光光度計(jì)Nano-100，離心機(jī)scilogex-D3024R，酶標(biāo)板脫水儀KS-Ⅰ，酶標(biāo)洗板機(jī)HBS-4009，恒溫箱HPX-9052MBE，數(shù)顯水浴恒溫振蕩器THZ-82，酶標(biāo)儀UVRSAmax(MD)，恒溫金屬浴MD-O2N。Human MBL 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、Human IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒、全血基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DNA Polymerase、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖粉、溴化乙啶均購(gòu)于大連寶生物公司；PCR引物購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。

1.4方法 3組研究對(duì)象于入院后采集空腹靜脈血1～3 mL，將1/2血液放入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝無(wú)菌收集管中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫羧〉臉?biāo)本盡量不要反復(fù)凍融，以免影響DNA提??；將另外1/2血液立即置于不加任何抗凝劑的干燥試管，于水浴箱37 ℃水浴1 h，后予以3 000 r/min離心10 min，分離血清置于無(wú)菌EP管內(nèi)，放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1全血DNA提取 取出全血標(biāo)本，加入20 μL Proteinase溶液，混勻。加入緩沖液GB，充分顛倒混勻，56 ℃放置10 min。加無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，將所得溶液和沉淀物都加入到吸附柱CB3中，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱中加入緩沖液GD(需要無(wú)水乙醇配置好備用)，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CB3打開室溫放置10 min,12 000 r/min離心30 s，將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴入120 L洗脫緩沖液TB，或者超純水，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。收集到DNA片段，利用微量核酸分析儀檢測(cè)所測(cè)樣本的DNA濃度和純度，光密度(OD)260/280為1.6～1.8，說(shuō)明提取的DNA純度較高，DNA濃度(μg/mL)=OD260值(DNA在波長(zhǎng)260 nm處為最大吸收值)×50 g/mL×稀釋倍數(shù)。樣本置于-20 ℃冰箱保存以備后續(xù)使用。

1.4.2MBL基因擴(kuò)增及啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)基因型頻率的分布 (1)引物設(shè)計(jì)和限制性內(nèi)切酶的確定：MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)存在C/G的等位基因頻率分布的差異，利用primer5.0軟件及參考文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物[6]，通過(guò)反復(fù)摸索條件，選擇出擴(kuò)增效果最佳的引物。引物序列如下：上游，5′-TGG GTT GGT GAC TAA GGT-3′；下游，5′-GGT AGG CAC TAT GAT GAG C-3′。選用特定的限制性內(nèi)切酶BtgI消化MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物。內(nèi)切酶BtgI能夠識(shí)別是5′-C↓CRYGG-3′序列，如果存在該酶切位點(diǎn)，MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)擴(kuò)增片段被切為98、285 bp的2個(gè)片段；不存在該酶切位點(diǎn)時(shí)，DNA擴(kuò)增片段不能被酶切，片段為384 bp。(2)擴(kuò)增體系：PCR擴(kuò)增體系設(shè)定為20 μL，10×PCR緩沖液2 μL，dNTP(2.5 μmol/L)2 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.125 μL，DNA模板0.5 μL，雙蒸水14.5 μL補(bǔ)足至20 μL。94 ℃預(yù)變性4 min后，進(jìn)行30次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)條件是94 ℃條件變性45 s、56 ℃條件退火45 s、72 ℃條件延伸1 min，30次循環(huán)結(jié)束后在72 ℃條件再延伸10 min。將配制好的反應(yīng)體系置于集合管中，PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增后，擴(kuò)增的產(chǎn)物標(biāo)記清楚后，備1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳后凝膠成像儀觀察擴(kuò)增效果，然后將目的條帶膠回收?；厥蘸螽a(chǎn)物再進(jìn)行酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物10 μL；BtgI 2 μL；緩沖液2 μL；雙蒸水6 μL。將以上體系混合后37 ℃水浴2 h，再以1%凝膠電泳成像后檢驗(yàn)。酶切產(chǎn)物顯示3種條帶：基因型CC(384 bp)，基因型GC(98、285、384 bp)，基因型GG(98、285 bp)。

1.4.3血清MBL、IL-17檢測(cè) 采用天根公司購(gòu)買人MBL、IL-17的ELISA試劑盒，具體操作方法見試劑盒說(shuō)明書，在波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各自O(shè)D值。將結(jié)果錄入Excel表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)(x)，對(duì)應(yīng)OD值作為縱坐標(biāo)(y)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照曲線方程計(jì)算各樣本濃度。

2 結(jié) 果

2.1MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)SNP檢測(cè)結(jié)果 各組CC、CG、GG基因型的檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組基因型比較[n(%)]

2.2各組兒童血清MBL、IL-17的水平比較 不同喘息次數(shù)兒童血清MBL水平與健康對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.50，P<0.05)；喘1組與喘2組兒童血清MBL水平之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.43，P<0.05)；不同喘息次數(shù)兒童血清IL-17水平與健康對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.50，P<0.05)；喘1組與喘2組兒童血清IL-17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.43，P<0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示，MBL與IL-17之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.91，P<0.05)。見表3。

表3 各組兒童血清MBL、IL-17比較

注：與健康對(duì)照組比較，▲P<0.05；與喘1組比較，*P<0.05

3 討 論

喘息是嬰幼兒呼吸道疾病常見的臨床表現(xiàn)，主要的發(fā)病機(jī)制是多種原因?qū)е職獾廓M窄。引起喘息的疾病很多，主要包括哮喘、毛細(xì)支氣管炎、喘息性支氣管炎等[6-7]。大多學(xué)者認(rèn)為，無(wú)論毛細(xì)支氣管炎還是支氣管炎伴有喘息者，喘息發(fā)作次數(shù)的增加將會(huì)導(dǎo)致哮喘傾向的增加。而支氣管炎癥的出現(xiàn)與機(jī)體免疫功能存在密切關(guān)系，其中自然免疫和體液免疫均占有重要作用[8]。

從自然免疫方面上來(lái)說(shuō)，在感染早期，體內(nèi)分泌MBL和C反應(yīng)蛋白。MBL與細(xì)菌表面的甘露糖殘基結(jié)合，然后與絲氨酸蛋白酶結(jié)合形成MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MASP)，MASP繼而水解C4和C2啟動(dòng)后序的酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)和最終發(fā)生細(xì)胞溶解作用的補(bǔ)體活化途徑，在自然免疫中起重要作用[9]。有研究指出，反復(fù)呼吸道感染與血清MBL水平密切相關(guān)，提示MBL下降會(huì)導(dǎo)致免疫力降低[10]。人MBL基因位點(diǎn)在10q11.2～q23，基因的變異會(huì)導(dǎo)致MBL的變化。迄今為止影響MBL基因多態(tài)性關(guān)鍵位置有6個(gè)[11]，其中啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)區(qū)的G/C基因頻率分布差異是研究熱點(diǎn)之一，但關(guān)于支氣管炎伴有不同喘息次數(shù)兒童的研究尚不多。本研究結(jié)果顯示，MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)的基因型頻率在各組的分布變化，CC基因型在健康對(duì)照組最高，為56.7%，喘2組最低，為43.3%，3組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GG基因型在健康對(duì)照組最低，為13.3%，喘1、2組相等，均為16.7%，3組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從結(jié)果看，MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)存在基因頻率分布的差異性，但各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

血清MBL水平在健康對(duì)照組最高，喘1組次之，喘2組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明MBL缺乏是導(dǎo)致易發(fā)感染性疾病的重要因素之一。本研究中MBL隨著發(fā)作次數(shù)增多而下降，表明隨著喘息次數(shù)增多兒童MBL具有下降趨勢(shì)。但MBL啟動(dòng)子-221位點(diǎn)的多態(tài)性各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分析原因可能為：(1)決定MBL血清水平的有多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性變化，啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)只是其中之一；(2)納入樣本量有限，不能完全反映體內(nèi)MBL真實(shí)水平變化。

MBL作用廣泛，研究顯示，MBL既具有調(diào)節(jié)固有免疫功能，還有調(diào)節(jié)獲得免疫的功能， MBL還可以促進(jìn)IL-12的分泌[12]，但關(guān)于是否對(duì)IL-17有影響的報(bào)道較少。IL-17由T輔助17(Th17)細(xì)胞產(chǎn)生，是一種新的促炎細(xì)胞因子家族，其含有6種不同的同種型(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F)[13]。IL-17作為促炎細(xì)胞因子，其可以誘導(dǎo)某些趨化因子、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和來(lái)自間質(zhì)和骨髓細(xì)胞的抗微生物肽的釋放來(lái)募集嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞[14-15]。IL-17能有效介導(dǎo)中性粒細(xì)胞動(dòng)員的興奮過(guò)程，從而有效介導(dǎo)組織的炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，喘1組和喘2組血清中IL-17水平高于健康對(duì)照組，喘2組血清中IL-17水平高于喘1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，MBL與IL-17之間呈負(fù)相關(guān)，提示MBL、IL-17均參與了喘息發(fā)作的過(guò)程，推測(cè)患兒喘息發(fā)作期間由于炎癥因子的釋放導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞亞群功能失衡，導(dǎo)致喘息的發(fā)生，隨著喘息次數(shù)的增多，氣道炎性反應(yīng)逐漸加重，由非過(guò)敏性喘息轉(zhuǎn)變成哮喘的可能性將增加。

本研究的局限在于僅研究了MBL啟動(dòng)子區(qū)-221位點(diǎn)的多態(tài)性變化，后期需要從其他位點(diǎn)的多態(tài)性分析并結(jié)合血清水平之間的相關(guān)性展開研究。