白雪晶，馮 磊，徐文波，趙 陽(yáng)，羅 風(fēng)，羅 旋

(昆明醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院/云南省玉溪市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 653100)

遺傳性耳聾指由于基因和染色體異常所致的耳聾，分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾，發(fā)病率較高，每1 000個(gè)新生兒當(dāng)中就有1～3個(gè)被確診，終生帶病，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[1]。大量的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，有4個(gè)基因是在中國(guó)耳聾人群中最為常見(jiàn)的突變基因，且所選擇的9個(gè)突變位點(diǎn)占這4個(gè)基因突變的80%～90%[2-3]。其中，GJB2基因與先天性耳聾密切相關(guān)，中國(guó)先天性耳聾患者中20%攜帶有GJB2基因的突變；線粒體基因突變與慶大霉素、鏈霉素等氨基糖苷類藥物引起的藥物性耳聾有密切關(guān)系；SLC26A4基因突變可以導(dǎo)致大前庭水管腫大綜合征；GJB3基金突變被認(rèn)為與高頻聽(tīng)力下降有關(guān)[4]。其中，GJB2和SLC26A4基因突變是由常染色體隱性遺傳引起的，線粒體基因突變是母系遺傳，GJB3基因突變表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳。本研究應(yīng)用遺傳性耳聾基因芯片試劑盒檢測(cè)玉溪市某特殊教育學(xué)校學(xué)生常見(jiàn)耳聾基因的突變情況，探討基因芯片技術(shù)在非綜合征性耳聾診斷中的應(yīng)用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇玉溪市某特殊教育學(xué)校的青少年非綜合征性耳聾患者131例為研究對(duì)象，均為玉溪市常住人口?；颊咧?，男64例，女67例；年齡8～23歲，中位年齡14歲；漢族70例，彝族29例，回族2例，傣族5例，哈尼族20例，蒙古族2例，拉祜族2例，基諾族1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有研究對(duì)象均2代以上為玉溪市常住人口；(2)聽(tīng)力檢測(cè)證實(shí)為重度、極重度感音神經(jīng)性非綜合征性耳聾。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)曾確診為急、慢性化膿性中耳炎病，有中耳手術(shù)史者；(2)其他疾病史，可引起聽(tīng)力下降者(包括顱面部外傷、腦膜炎、迷路感染等)；(3)伴有外耳、中耳畸形，引起傳導(dǎo)性聽(tīng)力下降者；(4)有明確的爆震傷、噪聲接觸史者；(5)曾使用過(guò)大劑量的非氨基糖苷類藥物史者；(6)伴有腦癱、智力發(fā)育障礙、因全身其他疾病影響聽(tīng)力檢測(cè)效果者；(7)綜合征性耳聾患者。本研究經(jīng)患者及其家屬知情同意，并獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1病史的調(diào)查 通過(guò)家屬填寫(xiě)聾啞患者登記表和電話家訪的方式掌握患者病史，包括耳聾發(fā)病年齡、家族史、個(gè)人史(感冒發(fā)燒史、耳毒性藥物使用史、頭部外傷史)等情況。

1.2.2外周血采集 由專職護(hù)士按照采血標(biāo)準(zhǔn)流程用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管采集受試者對(duì)象前臂外周血2 mL，特殊醫(yī)用冰盒保存血樣。

1.2.3基因組DNA提取 按照血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根DP319)說(shuō)明書(shū)提取血液基因組DNA。取一定量提取的DNA用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測(cè)，其余置-80 ℃冰箱備用。

1.2.4基因檢測(cè) 采用晶芯?九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(微陣列芯片法)[博奧生物集團(tuán)有限公司，國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3401518號(hào)]及其配套儀器進(jìn)行標(biāo)本的多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌及掃描，檢測(cè)樣本4個(gè)基因的9個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)[GJB2基因c.35 del G、c.176_191 del 6、c.235 del C、c.299 del AT；GJB3基因c.538C>T；SLC26A4基因c.2168A>G、c.IVS7-2A>G；線粒體基因(mtDNA)12SrRNA的m.1494C>T、m.1555A>G位點(diǎn)]，根據(jù)熒光雜交信號(hào)和耳聾基因微陣列芯片探針排布位置進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果判讀。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；當(dāng)樣本量小于40或理論頻數(shù)小于1時(shí)使用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1基因突變檢測(cè)結(jié)果 131例青少年耳聾患者中，攜帶遺傳性耳聾相關(guān)突變基因的患者為27例[28.3%(27/131)]。

2.2患者耳聾基因突變位點(diǎn)、類型及突變率 在131例青少年耳聾患者中，GJB2突變者20例[15.5%(20/131)]，包括c.235 del C純合突變11例(8.4%)，其中4例為漢族，2例為彝族，5例為哈尼族；c.235 del C單雜合突變3例(2.3%)，c.235 del C復(fù)合 c.299 del AT突變2例，c.235 del C復(fù)合c.176_191 del 6突變1例，均為漢族；c.176_191 del 6突變1例(0.8%)，c.299 del AT突變2例(7.4%)，均為漢族。SLC26A4突變者8例(6.1%)，均為漢族，包括c.2168A>G純合突變1例，c.2168A>G 單雜合突變3例，c.IVS7-2A>G純合突變3例，c.IVS7-2A>G單雜合突變1例。mtDNA的m.1555A>G位點(diǎn)均質(zhì)型突變2例(1.5%)，均為漢族，其他民族中未發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因9個(gè)位點(diǎn)的突變對(duì)象。

2.3不同民族耳聾患者的基因突變檢出率 漢族基因突變檢出率為28.6%(20/70)，彝族的檢出率為6.9%(2/29)，哈尼族的檢出率為25.0%(5/20)，回族、傣族、蒙古族、拉祜族、基諾族均未檢出基因突變。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，彝族、哈尼族與漢族耳聾基因突變檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)四格表確切概率法檢驗(yàn)，彝族與哈尼族耳聾基因突變檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4種耳聾基因的基因突變位點(diǎn)在玉溪各民族耳聾患者中檢出情況(n=27，n)

注：突變患者27例，其中3例為雙雜合突變，分別為c.235 del C/c.299 del AT 2例，c.235 del C/c.176_191 del 6 1例

3 討 論

耳聾包括常染色體顯性、常染色體隱性、X隱性或者線粒體遺傳[3-4]。非綜合性耳聾常染色體隱性遺傳最常見(jiàn)的原因是GJB2基因的突變[5-7]，GJB2的p.V37I變種在東亞地區(qū)具有很高的等位基因頻率(最高可達(dá)10%)[8-10]。在許多國(guó)家已經(jīng)對(duì)常染色體隱性遺傳(DFNB1)位點(diǎn)的突變譜、基因型-表型相關(guān)性，以及DFNB1與耳聾的相關(guān)性進(jìn)行了分析。突變譜和突變頻率由于種族、地理、社會(huì)和醫(yī)學(xué)因素的不同而存在差異，遺傳在發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。在歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家，2/3的耳聾病例由遺傳因素引起，約70%為非綜合征性耳聾，約30%為綜合征性耳聾[11]。剩下的1/3病例可以歸因于環(huán)境和未知的遺傳因素。在東亞的一些國(guó)家大約有1/2的病例是由遺傳引起的，非綜合征性耳聾占到60%～70%，其余的1/2病例歸因于其他環(huán)境和不能鑒別的遺傳因素[12]。

本研究通過(guò)對(duì)131例非綜合耳聾患者進(jìn)行GJB2(c.35 del G、c.176_191 del 6、c.235 del C、c.299 del AT)、SLC26A4(c.2168A>G、c.IVS7-2A>G)、GJB3(c.538C>T)和mtDNA 12SrRNA(m.1494C>T、m.1555A>G)4個(gè)耳聾相關(guān)基因的9個(gè)致聾突變位點(diǎn)的檢測(cè)，其中檢出率最高的是GJB2基因，其次為SLC26A4基因，這符合國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)[3-9]報(bào)道。耳聾基因的突變具有明顯的區(qū)域聚集性和民族差異性，云南是我國(guó)少數(shù)民族最多的省份，除漢族外，少數(shù)民族有25個(gè)，各民族分布呈大雜居，小聚居的特點(diǎn)，這為研究耳聾基因的民族差異性和區(qū)域聚集性提供了有利的條件。本研究發(fā)現(xiàn)，在青少年非綜合征性耳聾患者中，GJB2、SLC26A4、mtDNA基因的突變率分別為15.5%、6.1%、1.5%。GJB2最常見(jiàn)的類型是c.235 del C突變，SLC26A4 基因的c.2168A>G，c.IVS7-2A>G突變率相同。不同耳聾致病突變位點(diǎn)的攜帶率存在地區(qū)差異，各地區(qū)應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)厝巳旱臄y帶情況選擇篩查位點(diǎn)。

綜上所述，本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)131例青少年耳聾患者進(jìn)行檢測(cè)，從分子水平上為耳聾患者提供明確的分子病因?qū)W診斷，同時(shí)得出非綜合性耳聾患者以GJB2基因和SLC26A4基因?yàn)樽钪饕闹虏』?。其中c.235 del C突變?yōu)樽畛Ｒ?jiàn)突變位點(diǎn)，其次為c.IVS7-2A>G和c.2168A>G突變。