張文萍，張秋萍，李冬玲，張仲明，楊燕梅，羅燕婷，單萬水△

(1.廣東省深圳市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 518114；2.廣東省深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科 518019)

依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2008年的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室診斷是瘧疾患者確診和及時(shí)得到治療的基礎(chǔ)。目前實(shí)驗(yàn)室開展的方法主要包括血涂片鏡檢方法、快速免疫層析試紙條法和分子診斷法[1]；而鏡檢瘧原蟲迄今仍是確診瘧疾最迅速、最直觀、最經(jīng)濟(jì)且實(shí)用器材簡便，結(jié)果最可靠的方法。瘧原蟲鏡檢是瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員，盡管目前可以通過形態(tài)學(xué)分析圖像自動檢測識別瘧原蟲，但是制片和染色仍然是關(guān)鍵[2-3]。本課題組成員通過近幾年的不斷摸索改進(jìn)，制作出檢測瘧原蟲的厚涂片，同時(shí)制訂出一套評分標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)判斷結(jié)果的優(yōu)劣，使判斷標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年12月深圳市第三人民醫(yī)院首次檢出的46例瘧原蟲陽性患者為研究對象，收集其乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝外周血標(biāo)本，每份標(biāo)本約5 mL，用于厚血膜的制作。

1.2儀器與試劑 姬姆薩染液由(臺資)珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，高品質(zhì)顯微鏡載玻片世泰牌規(guī)格為26 mm×76 mm，厚度1.0～1.2 mm；數(shù)字顯示鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9140 MBE)；萊卡顯微鏡(德國DM 3000 LED)。

1.3制片和染色方法[4-5]

1.3.1厚血膜制作方法及分組情況 在白色硬紙上制作好玻片模具(直徑為0.8、1.0、1.2 cm的圓圈，1張玻片上可同時(shí)劃2個(gè)大小相同的圓圈)，將玻片置于10%的稀鹽酸浸泡24 h后、蒸餾水沖洗干凈后瀝干，裝玻片盒里待用；試驗(yàn)時(shí)將處理過的玻片置于模具上，準(zhǔn)確吸取血標(biāo)本3.0、4.0、5.0 μL和4.6 μL，分別置于0.8、1.0、1.2 cm的圓心上，用玻片一側(cè)的鈍角自內(nèi)向外涂成相應(yīng)直徑的圓形均勻的血膜，每張玻片上可做2個(gè)厚血膜，每份標(biāo)本根據(jù)應(yīng)用血量和其相應(yīng)直徑的各項(xiàng)條件制作6個(gè)厚血膜，相當(dāng)于試驗(yàn)重復(fù)6次，保證了可重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。且每項(xiàng)相同試驗(yàn)條件作出3張片子上有6個(gè)厚血膜以1人份計(jì)，取其6個(gè)厚血膜評分的平均值納入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中。分組情況：用血量分別為3.0、4.0、5.0 μL、直徑0.8 cm厚血膜為直徑0.8 cm組；用血量分別為3.0、4.0、5.0 μL、直徑1.0 cm的厚血膜為直徑1.0 cm組；用血量分別為3.0、4.0、5.0 μL、直徑1.2 cm的厚血膜為直徑1.2 cm組。

1.3.2染色方法 制作一個(gè)避光器皿裝配好的應(yīng)用染液，按照實(shí)驗(yàn)的要求將染液和緩沖液配成相應(yīng)的比例混勻置于避光器皿中現(xiàn)稀釋現(xiàn)用，將干透的厚血膜置于染色架上，將應(yīng)用染液滴于按照1.3.1方法制好的血膜，本實(shí)驗(yàn)將染液和緩沖液按照1∶19、1∶9、3∶7、2∶8比例稀釋，每組染色時(shí)間為10、20、30、40 min后，用鑷子穩(wěn)抓玻片，垂直輕輕浸于準(zhǔn)備好的蒸餾水，讓厚血膜浸沒水中后輕而迅速提上來，重復(fù)2～3次，瀝干后待鏡檢。制作好自然干透的厚血膜在顯微鏡下先后進(jìn)行10×100倍選視野，100×100倍觀察形態(tài)，瘧原蟲的核呈紫紅色、胞漿呈現(xiàn)淺藍(lán)色，形狀呈現(xiàn)點(diǎn)狀、逗號以及弧形、偶有配子體為陽性標(biāo)本?？芍貜?fù)性和穩(wěn)定性檢測參照文獻(xiàn)[6-7]。

1.4結(jié)果判讀 將制作好的各直徑的厚血膜自然干燥3 h，結(jié)果以總體評分最高者為優(yōu)(評分標(biāo)準(zhǔn)參照表1)。不同用血量和不同直徑對厚血膜制片效果影響的評分標(biāo)準(zhǔn)，通過觀察厚血膜的干燥程度、沖片時(shí)血膜是否有脫落及脫落的程度、兼顧經(jīng)染色后的血膜對光觀察它的透光度等進(jìn)行評分；厚血膜的染色效果通過鏡檢觀察確定評分標(biāo)準(zhǔn)(評分標(biāo)準(zhǔn)參照表2)。參照前期厚血膜得分最高為制作方法做出的血膜干透后染色，首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，姬姆薩染液和配套緩沖液分別按1∶19、1∶14、1∶9、3∶7、2∶8的比例稀釋，染色時(shí)間分別為10、15、20、25、30、35、40 min。通過預(yù)試驗(yàn)確定染色濃度為姬姆薩染液和配套緩沖液分別按1∶19、1∶9、3∶7、2∶8的比例稀釋，染色時(shí)間分別為10、20、30、40 min作為最終試驗(yàn)，厚血膜染色效果評分分為4個(gè)等級，A級：>7～9分；B級：>5～7分；C級：3～5分；D級：3分以下。 評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)廣東省疾病預(yù)防控制中心多位專家多次研討會議擬定，且參照許文榮等[8]判斷標(biāo)準(zhǔn)，每份標(biāo)本的判斷均由3位對厚血膜制作具有豐富經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員共同商定共識的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1不同用血量和不同直徑對厚血膜制片效果影響 直徑0.8 cm組和直徑1.2 cm組中得分均集中在3～5分；直徑1.0 cm組得分集中在4～6分，其中用血量4.0 μL和用血量5.0 μL的血膜得分在5～6分所占比例最大，直徑1.0 cm組中血量5 μL中得分最高者6分的占45.7%，結(jié)合試驗(yàn)呈現(xiàn)此結(jié)果，筆者將用血量細(xì)化到用血量4.6 μL，發(fā)現(xiàn)得分在5～6分所占比例相對于用血量4.0 μL和5.0 μL的比例有增加，見表3。

表1 厚血膜制片評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 厚血膜的染色效果評分標(biāo)準(zhǔn)

表3 直徑0.8、1.0、1.2 cm組中厚血膜制片效果評分情況[n(%)]

注：-表示該項(xiàng)無數(shù)據(jù)

表4 不同染液比例和不同染色時(shí)間對厚血膜染色效果的評分結(jié)果[n(%)，n=46]

2.2不同染液比例和染色時(shí)間對染色效果影響的評分 3∶7染色10 min和1∶9染色30 min評分中出現(xiàn)A級比例最多，分別占52.2%和58.7%，達(dá)到良好，令人滿意的效果。見表4。

3 討 論

顯微鏡鏡檢瘧原蟲診斷是臨床確診的依據(jù)，且顯微鏡鏡檢瘧原蟲血涂片分為厚血膜和薄血膜，厚血膜能使瘧原蟲濃集，易被發(fā)現(xiàn)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)陽性率是薄血膜的20倍[9-10]。

薄血膜制作操作簡單，且固定后染色受影響因素小，主要用于觀察紅細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲的結(jié)構(gòu)，判斷出瘧疾的分型及發(fā)育階段，但發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染是診斷的前提，因此成功制作厚血膜是診斷瘧疾的關(guān)鍵。本研究旨在在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下，通過科學(xué)的血涂片判斷的標(biāo)準(zhǔn)積分系統(tǒng)評價(jià)制片的優(yōu)劣等級，通過大量的試驗(yàn)去比較，尋找出厚血膜最佳的制片和染色方法以便推廣應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)室工作人員在2014年以前采用文獻(xiàn)[6-7]的制作方法，先使用蒸餾水溶解厚血膜中紅細(xì)胞，再進(jìn)行染色，實(shí)際操作中卻發(fā)現(xiàn)這種方法血膜容易脫落、使得第2步驟應(yīng)用染液被稀釋不可控因素較多，兩個(gè)步驟很難標(biāo)準(zhǔn)化；再者，筆者在實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)多次使用文獻(xiàn)[6]離心的方法，但使用抗凝血標(biāo)本混勻后直接加全血制成的血膜自然干透時(shí)間更短，縮短了報(bào)告時(shí)間，且不離心制成的血膜相對于離心后取細(xì)胞層制成的血膜穩(wěn)固且紅細(xì)胞易溶解，這可能與未離心的血含有一定的血漿等有效成分黏附性較強(qiáng)容易貼于玻片，且紅細(xì)胞密度相對較少易于溶解完全。由此可見，經(jīng)過長期的不斷探索和持續(xù)改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)采用本研究制片方法操作簡單、成功率高，便于鏡檢觀察，迄今未有漏檢。

試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)瘧原蟲厚血膜涂片制作質(zhì)量與其直徑和用血量關(guān)系密切。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，血膜太小或太大均容易脫落，長期試驗(yàn)結(jié)果顯示，直徑為0.8～1.2 cm的厚血膜不易脫落，這可能跟血膜干透過程中的表面張力有關(guān)。本研究結(jié)果表明，直徑0.8 cm組中厚血膜直徑越小，用血量最大(如0.8 cm、5.0 μL)，所制作出的厚血膜沖片時(shí)越易掉落，且透光度越低。而直徑1.2 cm組直徑越大，用血量越少的厚血膜(如1.2 cm、3.0 μL)透光度越好，但是血膜干燥后受張力等因素的影響，一方面會使其干燥后易出現(xiàn)裂痕，另一方面用血量少所能觀察到的瘧原蟲在數(shù)量上會相應(yīng)地減少；直徑1.2 cm組的厚血膜隨著用血量的增大其干燥情況越好，沖片情況也愈好，但其透光度就相對減低。直徑1.0 cm組中各用血量的厚血膜穩(wěn)定性均能取得較好的效果，但是是3.0 μL、1.0 cm的厚血膜血量較少，干燥情況欠佳，且鏡下所能看到的瘧原蟲數(shù)量會相應(yīng)地減少，試驗(yàn)中用血量4.6 μL做成的直徑1.0 cm效果最好，蟲體能均勻散開且密度也可觀。而5.0 μL、1.0 cm的用血量沖片時(shí)較1.0 cm、4.0 μL和4.6 μL的厚血膜易掉，透光度也相應(yīng)地降低。試驗(yàn)中長期不斷摸索發(fā)現(xiàn)，制好的血膜透光性越好，表明血膜溶血越完全。

最佳的染色狀態(tài)是瘧原蟲和白細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成藍(lán)色，瘧原蟲的核和白細(xì)胞核被染成紫紅色[11]，比較對不同染色時(shí)間和不同染液濃度制成的厚血膜試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大部分染色效果都能達(dá)到B級和C級，只有合適的染色時(shí)間和配制合適的染液比例能達(dá)到A級。從本研究結(jié)果可見，染液濃度高，其著色就快而深，但顏色常偏堿，偏堿時(shí)白細(xì)胞的嗜伊紅顆粒等被染成紫藍(lán)色，不易察覺。濃度偏低且染色時(shí)間長效果才好，染色時(shí)間短反映出的效果顏色偏酸[12]。

1∶9染色30 min和3∶7染色10 min均能達(dá)到理想的染色效果，即總體評分能達(dá)到5～6分。而3∶7染色10 min在時(shí)間上更有優(yōu)勢，最佳染色條件受其所在實(shí)驗(yàn)室條件所制約，因?yàn)槿旧Ч麜苋疽?、緩沖液質(zhì)量和染色用水等因素的影響，而該研究中只需沖片時(shí)才用到水，為本實(shí)驗(yàn)室制備的普通去離子水即可，此方法與唐瓊?cè)A等[13]的改良方法相似，均將溶血與染色合為一步完成相同，不同之處為本研究方法采用的染液是姬姆薩染液，易于購買，適合于類似本實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)條件的其他血液寄生蟲的檢查，易于標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性與穩(wěn)定性的高，可操作性強(qiáng)。

綜上所述，不同直徑和用血量對厚血膜的制作效果有一定的影響，研究結(jié)果顯示，用血量為4.6 μL、直徑為1.0 cm制作的血膜效果為最佳；染液和緩沖液按1∶9稀釋染色30 min、染液和稀釋液按3∶7稀釋染色10 min均能達(dá)到理想的染色效果，試驗(yàn)中染液和緩沖液配制后避光2 h內(nèi)用完。