麥耀寶，陳智光，陳灼均，李本旺，林 強(qiáng)

（1.東莞市長安鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523850；2.東莞市水生動物防疫檢疫站，廣東 東莞 523126；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380）

云斑尖塘鱧（Oxyeleotris marmoratus），隸屬鱸形目蝦虎魚亞目塘鱧科尖塘鱧屬，產(chǎn)于柬埔寨、泰國和越南等國，是熱帶、亞熱帶的優(yōu)質(zhì)淡水魚之一[1]，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高而廣受消費(fèi)者的喜愛。然而，隨著近年來集約化養(yǎng)殖程度的提高，云斑尖塘鱧的各種病害頻繁發(fā)生，如虹彩病毒、彈狀病毒、爛身、黑身、打轉(zhuǎn)、肝膽綜合征、寄生蟲病等[2]，其中爛身病在云斑尖塘鱧養(yǎng)殖過程中非常常見，但是其原因一直不清楚。維氏氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一種常見條件致病菌，可感染多種水生動物，如草魚、鯉魚、鯽魚、羅非魚、中華絨蟹、鱘魚、叉尾鮰、鰻鱺等[3-12]，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。2017年4月東莞市某養(yǎng)殖場云斑尖塘鱧發(fā)生出血爛身癥狀，每天死亡30～50尾魚。病魚主要癥狀為體表浮腫、鰭條、肌肉糜爛，肝臟發(fā)白、脾臟腫大。本研究首次對該病的病原進(jìn)行分離鑒定，從患爛身病的云斑尖塘鱧中分離到優(yōu)勢菌株WSQ-01，回歸試驗(yàn)證明該菌可以復(fù)制出爛身癥狀，對云斑尖塘鱧具有較高致病性。通過測定其16S rRNA序列并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果證實(shí)爛身病為致病性維氏氣單胞菌感染所致，并進(jìn)一步研究了該菌株的藥敏特性，以期探討云斑尖塘鱧爛身病的病原并為該病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試劑：腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋有限責(zé)任公司，按照說明配制；血平板購自廣東微生物科技有限公司；藥敏紙片購自浙江杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌DNA試劑盒、PCR反應(yīng)體系均購自天根生化科技（北京）有限公司；生化鑒定試劑條ID32E購自法國Biomerieux公司。

16S rRNA通用引物：上游引物16SF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物16SR：5′-CTACGGTTACCTTGT TACGAC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

試驗(yàn)魚：云斑尖塘鱧病魚10尾取自廣東東莞某養(yǎng)殖場，體長15（±3）cm；健康的云斑尖塘鱧100尾，體長15（±2）cm購自東莞市松湖水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，暫養(yǎng)在水池中，水溫保持在28（±2）℃，24 h連續(xù)不間斷充氧。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原的分離與純化 選取具有典型發(fā)病癥狀的云斑尖塘鱧瀕死魚，無菌水沖洗體表后，用75%酒精棉球擦拭體表，在無菌條件下用接種環(huán)取病魚的肝臟、脾臟、腎臟和肌肉樣品，劃線接種血瓊脂平板，28℃恒溫培養(yǎng)24 h；挑取優(yōu)勢菌落，在腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)2次。

1.2.2 病原菌分子鑒定 將純化后的細(xì)菌WSQ-01接種于BHI液體培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)過夜，提取其DNA作為PCR反應(yīng)模板。根據(jù)預(yù)期擴(kuò)增長度1 500 bp，PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括：PCR 反應(yīng)液（含 Buffer、4×dNTP、Mg2+、Tap聚合酶）25 μL，上下游引物各1 μL，Tap聚合酶1 μL（5 U/μL），DNA 模板 2 μL，RNA-Free水 21 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s、53℃復(fù)性45 s、72℃延伸90 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸8 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用膠回收試劑盒回收純化（OMEGA公司）?；厥债a(chǎn)物連接到pMD18-T載體中（Takara公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定挑選陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將獲得的序列與NCBI網(wǎng)站GenBank庫中的鄰近種屬的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較。根據(jù)結(jié)果，從 GenBank數(shù)據(jù)庫選取與所分析的細(xì)菌基因序列同源性較高的已知相關(guān)序列，采用MEGA 5.20軟件進(jìn)行多重序列匹配分析，用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 回歸感染試驗(yàn) 試驗(yàn)隨機(jī)放置健康的云斑尖塘鱧30尾，用分離到的菌株進(jìn)行腹腔注射，菌液濃度為4.0×107CFU/mL，注射劑量為0.2 mL/尾，用生理鹽水進(jìn)行腹腔注射作對照。連續(xù)7 d觀察和記錄各組魚的發(fā)病和死亡情況，并對瀕死魚體及時進(jìn)行解剖和病原菌的再次分離。

1.2.5 藥敏實(shí)驗(yàn) 將分離到的菌株培養(yǎng)24 h并制成108CFU/mL的菌懸液。取100 μL菌液均勻涂布于腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼在培養(yǎng)基表面，于28℃下恒溫培養(yǎng)24 h。記錄各藥敏紙片抑菌圈的直徑，根據(jù)藥敏紙片生產(chǎn)廠家推薦的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化

從患病的云斑尖塘鱧肝臟、脾臟、腎臟和肌肉中均分離到數(shù)量較多且形態(tài)一致的菌落。這些菌株在血平板可形成明顯的β溶血圈，在腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基平板上呈有光澤的圓形白色或灰白色菌落，表面濕潤、光滑、微隆起、邊緣整齊，顯微鏡下為革蘭氏染色陰性的短桿菌。

2.2 分子鑒定

用16S rRNA通用引物擴(kuò)增這些菌株的DNA，獲得長度約1 500 bp的片段。將測定的菌株序列遞交到GenBank中進(jìn)行Blast同源性分析，結(jié)果表明，所測基因序列均為相同序列，說明這些菌株都是同一菌株，命名為WSQ-01，與已登陸的維氏氣單胞菌的16S rRNA相應(yīng)基因序列的同源性均為99%；所測基因序列與GenBank中已登錄的氣單胞菌屬的常見種進(jìn)行比對，結(jié)果表明H WSQ-0與維氏氣單胞聚為一簇，故確定該菌為維氏氣單胞菌。序列比對的同源性分析與進(jìn)化樹構(gòu)建如圖1所示。

圖1 菌株WSQ-01 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 回歸感染試驗(yàn)

通過腹腔注射對健康云斑尖塘鱧魚進(jìn)行人工侵染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染后7 d內(nèi)死亡18尾魚，感染7 d后魚不再死亡，累計死亡率為60%。發(fā)病魚的癥狀為呼吸加快，在水中活力減弱，部分鰭條有出血現(xiàn)象，部分出現(xiàn)爛身癥狀。在無菌條件下，從人工感染發(fā)病的云斑尖塘鱧肝臟中分離的菌株16S rRNA基因序列與WSQ-01株16S rRNA基因序列相同，表明WSQ-01是云斑尖塘鱧爛身病的致病性病原。

2.4 藥敏試驗(yàn)

用 K-B 法對WSQ-01進(jìn)行藥物敏感性測試，在13種供試藥物中，四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、紅霉素、氟苯尼考、利福平、頭孢他啶、氧氟沙星、左氟沙星和恩諾沙星對該菌的作用較強(qiáng)，說明細(xì)菌對這10種藥物敏感，而對氨曲南、鏈霉素和阿莫西林具有耐藥性（表1）。

表1 菌株WSQ-01對不同抗菌藥物的敏感性

3 結(jié)論與討論

云斑尖塘鱧從20世紀(jì)80年代引入我國以來，因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富和經(jīng)濟(jì)價值高，深受廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的增加，云斑尖塘鱧的病害也越來越多，其中云斑尖塘鱧的爛身在養(yǎng)殖過程中非常普遍，在整個養(yǎng)殖過程中都有發(fā)生。2017年3月，東莞市某云斑尖塘鱧養(yǎng)殖場的云斑尖塘鱧一直以來陸陸續(xù)續(xù)出現(xiàn)死亡，發(fā)病的魚大多出現(xiàn)鰭條爛，肌肉糜爛、脾臟腫大等癥狀，多種藥物的治療效果都不明顯。本試驗(yàn)對爛身的云斑尖塘鱧進(jìn)行致病菌分離和鑒定，通過對該菌的16S rDNA與其他維氏氣單胞菌的同源性檢測，初步將該菌確定為維氏氣單胞菌，并通過回歸感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)了維氏氣單胞菌為該病的病原。

維氏氣單胞菌屬于氣單胞菌屬，氣單胞菌是一種在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的革蘭氏陰性菌。氣單胞菌廣泛分布于自然界中，是一種世界性分布的條件致病細(xì)菌，可引起多種疾病的發(fā)生。水產(chǎn)養(yǎng)殖常見的氣單胞菌包括嗜水氣單胞菌[3]、維氏氣單胞菌[4]、溫和氣單胞菌[14]、豚鼠氣單胞菌[15]、舒氏氣單胞菌[16]、殺鮭氣單胞菌[17]等。其中維氏氣單胞菌可以造成動物的局部出血和炎癥，嚴(yán)重時可造成敗血癥，危害嚴(yán)重，在草魚、鱖魚、加州鱸、中華絨蟹、鱘魚、鯉魚、叉尾鮰、鯽魚、鰻鱺、羅非魚等水生生物上均分離到該致病菌[3-12]。據(jù)文獻(xiàn)報道，從爛身的水生動物中，除了可以分離到維氏氣單胞菌，還可以分離到嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌等。由此可見，爛身可能并不是由特定某種病原造成的，而是由于魚體體表受損導(dǎo)致病原菌入侵，細(xì)菌在局部增殖，造成感染部位的損傷，出現(xiàn)爛身和潰瘍癥狀，繼而細(xì)菌通過血液進(jìn)入內(nèi)臟組織，大量繁殖產(chǎn)生毒素造成魚體死亡。

維氏氣單胞菌有多種血清型，每個區(qū)域每個季節(jié)流行的株型可能都不一樣。本試驗(yàn)雖然進(jìn)行了WSQ-01株的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌對多種藥物敏感，生產(chǎn)上可以用恩諾沙星等進(jìn)行治療。維氏氣單胞菌是一種條件致病菌，當(dāng)水環(huán)境變差、機(jī)體應(yīng)激、受傷或免疫力下降時均可能導(dǎo)致感染該菌。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，開春拆棚時的應(yīng)激、長期投喂冰鮮餌料、水質(zhì)惡化等均可能導(dǎo)致云斑尖塘鱧爛身的發(fā)生，因此合理規(guī)劃放養(yǎng)密度，加強(qiáng)水質(zhì)和底質(zhì)的管理，增強(qiáng)魚體免疫力，也是防控此病的重要措施。