邵留英 ，瞿發(fā)林 △，董文，倪玉佳，鐘 月

（1．中國人民解放軍第102醫(yī)院，江蘇 常州 213003； 2．南京中醫(yī)藥大學翰林學院，江蘇 泰州 210046）

中藥顆粒劑具有服用、攜帶、貯藏、運輸方便等特點，深受廣大患者歡迎。復方芍甘顆粒的處方出自醫(yī)圣張仲景《傷寒雜病論》的芍藥甘草湯，具有益氣、養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)、復脈的功效。芍藥甘草湯可治療抗精神病藥所致的高催乳素血癥［1－2］。我院在此湯劑基礎(chǔ)上增加炙甘草，采用現(xiàn)代制劑制成顆粒［3－4］。為控制制劑質(zhì)量，本研究中對其質(zhì)量標準進行了研究?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

高效液相色譜儀（包括CapLC2487紫外檢測器，美國Waters公司）；FA1004型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；DHG9240型鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；KH2200DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；XS105型電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）。

1．2 試藥

復方芍甘顆粒（中國人民解放軍第102醫(yī)院自制，批號分別為 201703301，201703302，201703303）；白芍對照藥材（批號為B26034－1g），甘草對照藥材（批號為B26212－1g），均由上海源葉生物科技有限公司提供；芍藥苷對照品（批號為110736－201438，含量以96．4%計算），甘草酸銨對照品（批號為110731－200614），均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法

2．1 定性鑒別

白芍［5－9］：取樣品適量，研細，稱取 0．2 g，置容量瓶中，加乙醇10 mL，30℃下超聲提取（功率為100 kHz），處理30 min，過濾，取濾液水浴蒸干，殘渣加20 mL水溶解，正丁醇液提取3次，每次20 mL合并正丁醇液，用適量水洗滌，取正丁醇液蒸干，殘渣用1 mL乙醇溶解，即得供試品溶液。取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加乙醇定容制成質(zhì)量濃度為1 g／L的溶液，即得對照品溶液。稱取0．5 g白芍對照藥材，同法制備對照藥材溶液。按處方組成制備不含白芍的復方芍甘顆粒，稱取0．1 g，同法制備陰性對照品溶液。分別精密吸取上述溶液各2 μL，點樣至同一硅膠G薄層板，以三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯 －濃氨溶液（8∶4∶1∶1）展開，取出，晾干，噴以 5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點清晰。對照品溶液與對照藥材溶液、供試品溶液色譜在同一 Rf值處有相同的藍紫色斑點，陰性無干擾。色譜圖見圖1 A。

炙甘草［10－11］：取樣品適量，研細，稱取 0．9 g 置圓底燒瓶中，加乙醚40 mL，回流提取1 h，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣用甲醇30 mL回流提取1 h，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用適量水洗滌，取正丁醇液蒸干，殘渣用5 mL甲醇溶解，即得供試品溶液。取甘草酸銨對照品適量，加甲醇定容制成質(zhì)量濃度為2 g／L的溶液，即得對照品溶液。稱取1 g甘草對照藥材，同法制備對照藥材溶液。按處方組成制備不含炙甘草的復方芍甘顆粒，稱取0．5 g，同法制備陰性對照品溶液。分別精密吸取上述溶液各2 μL，點樣至同一硅膠GF254薄層板（以1%NaOH溶液制備），用乙酸乙酯 －甲酸 －水－冰醋酸（15∶2∶2∶1）展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點清晰，取出，置紫外燈（254 nm）下檢視。對照品溶液與對照藥材溶液、供試品溶液色譜在同一 Rf值處有相同顏色斑點，陰性無干擾。色譜圖見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2．2 芍藥苷含量測定［12］

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：月澤 Ze month ODS－L C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；流動相：乙腈 －0．1%磷酸溶液（14 ∶86）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，處方中其他成分對芍藥苷的測定無干擾，色譜圖見圖2。

2．2．2 溶液制備

取復方芍甘顆粒（批號為201703301）適量，研細，取細粉0．4 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲提?。囟葹?0℃，頻率為100 kHz）30 min，取出，放冷，加水定容，搖勻；精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，離心 10 min，取上清液，用 0．45 μm微孔水膜過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。取芍藥苷對照品，精密稱取 12．16 mg，加水制成質(zhì)量濃度為121．6 μg／mL的對照品貯備液；精密量取對照品貯備液5 mL，加水制成質(zhì)量濃度為 60．8 μg／mL 的對照品溶液。按處方組成制備不含白芍的復方芍甘顆粒，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2．2．3 方法學考察

線性關(guān)系考察：精密量取芍藥苷對照品貯備液1．0，2．5，5．0，7．5，10．0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用水定容，混勻，制成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，依法進樣，測定峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝716 782X－20 858，r＝0．999 7（n＝7）。結(jié)果表明，芍藥苷進樣量在0．263 2 ～2．632 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于0，4，8，12，24 h時按擬訂色譜條件進樣。結(jié)果的 RSD為1．50%（n＝5），表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為201703301）6份，精密稱定，分別制備供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0．94%（n＝6），表明方法重復性良好。

精密度試驗：精密量取質(zhì)量濃度為60．8 μg／mL的芍藥苷對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進樣6次。結(jié)果的 RSD為0．34%（n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為201703301，芍藥苷含量為 27．51 mg／g）9 份，精密稱定，每份 0．2 g，置 50 mL容量瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為2．631 7 g／L的芍藥苷對照品溶液1，2，3 mL，平行操作3份，按擬訂色譜條件進樣測定峰面積，計算回收率（n＝6）。結(jié)果見表1。

圖2 芍藥苷含量測定高效液相色譜圖

表1 芍藥苷加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

2．2．4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，采用外標法計算含量。結(jié)果批號為201703301，201703302，201703303的樣品中芍藥苷含量分別為2．45%，2．44%，2．45%，平均 2．45%。

2．3 甘草酸銨含量測定［5］

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：月澤 Ze month ODS－L C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；檢測波長：250 nm；流動相：乙腈 －0．017 mol／mL 磷酸溶液（35 ∶65）；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，處方中其他成分對甘草酸銨的測定無干擾，色譜圖見圖3。

圖3 甘草酸銨含量測定高效液相色譜圖

2．3．2 溶液制備

取樣品（批號為201703301）適量，研細，精密稱取細粉0．200 3 g，分別置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲提?。囟葹?0℃，頻率為100 kHz），處理30 min，取出，放冷，加水定容至刻度，搖勻，離心10 min，取上清液，用0．45 μm微孔水膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取甘草酸銨對照品，精密稱取10．75 mg，加水制成質(zhì)量濃度為210．64 μg／mL的對照品貯備液；精密量取對照品貯備液5 mL，加水制成質(zhì)量濃度為105．32 μg／mL的對照品溶液。按處方組成制備不含炙甘草的復方芍甘顆粒，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2．3．3 方法學考察

線性關(guān)系考察：精密量取甘草酸銨對照品貯備液1．0，2．5，5．0，7．5，10 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用水定容，混勻，制成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣，測定峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝752 553X －760 29，r＝0．999 8（n＝5）。結(jié)果表明，甘草酸銨進樣量在 0．421 28 ～4．212 80 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24 h時按擬訂色譜條件進樣。結(jié)果的 RSD為0．42%（n＝5），表明供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：精密稱定同批樣品（批號為201703301）6份，分別制備供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為1．28%（n＝6），表明方法重復性良好。

精密度試驗：精密量取質(zhì)量濃度為105．32 μg／mL的甘草酸銨對照品溶液，按擬訂條件依法重復進樣6次。結(jié)果的 RSD為0．85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：精密稱取同一批樣品（批號為201703301，甘草酸銨含量為13．27 mg／g）9份，每份0．1 g，置25 mL容量瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為0．635 g／L甘草酸銨對照品溶液1，2，3 mL，平行操作3份，依法制備供試品溶液，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果見表2。

2．3．4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別測定峰面積，計算含量。結(jié)果批號為201703301，201703302，201703303樣品中甘草酸銨含量分別為1．32%，1．33%，1．33%，平均 1．33%。

3 討論

3．1 定性鑒別

芍藥苷提取方法：考察2015年版《中國藥典（一部）》白芍中芍藥苷的提取方法，但雜質(zhì)多、分離效果差。改用水飽和正丁醇液提取，正丁醇飽和水液洗滌［8］，結(jié)果雜質(zhì)少、分離效果好、斑點清晰。

芍藥苷展開劑：以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（40 ∶5 ∶10 ∶0．2）［9］為展開劑，陰性有干擾；以乙酸乙酯 － 甲酸 －乙酸 － 水（15 ∶2 ∶1 ∶2）［10］為展開劑，陰性無干擾，但展開效果不好；最終確定三氯甲烷－甲醇－乙酸乙酯 －濃氨溶液（8 ∶4 ∶1 ∶1）［12］展開的效果最好，Rf值為 0．4，陰性無干擾。

表2 甘草酸銨加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

芍藥苷點樣量、展開溫度：考察供試品溶液、對照品溶液和對照藥材溶液點樣量1，2，3 μL，以展開劑展開、顯色劑顯色、檢視，結(jié)果表明，點樣量均為2 μL時斑點圓整、清晰；取供試品溶液、對照品溶液和對照藥材溶液點于同一硅膠G板上，以展開劑分別在6，20，35℃展開、顯色劑顯色、檢視。結(jié)果表明，在20℃時，溶液分離效果最佳。故選擇點樣量均為2 μL，溫度為20℃的條件展開。

甘草酸銨薄層板：曾在硅膠G薄層板上點樣，結(jié)果展開效果差、斑點不清晰；改在硅膠GF254薄層板上點樣，結(jié)果展開效果好、斑點清晰。

甘草酸銨展開劑：以乙酸乙酯、甲酸、冰醋酸、水（15 ∶1 ∶1 ∶2）［13］展開，Rf值偏小，故調(diào)整比例，以乙酸乙酯、甲酸、水、冰醋酸（15 ∶2 ∶2 ∶1）展開，陰性無干擾，分離效果好。

甘草酸銨點樣量、展開溫度：考察供試品溶液、對照品溶液和對照藥材溶液點樣量 1，2，3 μL，以展開劑展開、顯色劑顯色、檢視，結(jié)果表明，點樣量均為2 μL時斑點清晰，易于辨識；取供試品溶液、對照品溶液和對照藥材溶液點于同一硅膠GF254薄層板上，以展開劑分別在6，20，35℃展開，顯色劑顯色，檢視，結(jié)果表明，在20℃時，溶液的展開效果好，Rf值適當。故選擇點樣量均為2 μL、溫度為20℃的展開條件。

3．2 含量測定

提取溶劑與方法：根據(jù)芍藥苷、甘草酸銨的理化特性，選用了甲醇、乙醇、70%乙醇、水為提取溶劑，超聲提取，以水提取效率最高，峰形對稱，雜質(zhì)對主峰無干擾，故本試驗中選擇水為提取溶劑。再對水超聲提取和回流提取的提取效率進行考察，結(jié)果顯示，兩種提取方式效率無明顯差異，且超聲提取操作簡單，最終選擇超聲提取。

提取溫度與時間：考察了提取溫度、提取時間對提取效率的影響，結(jié)果顯示，提取溫度超過30℃，提取效率無明顯增加；而提取時間超過30 min，提取效率變化亦不明顯，故選擇溫度為30℃、超聲30 min提取。

流動相及檢測波長：曾參考文獻［3］采用乙腈－0．017 mol／L 磷酸水溶液 －三乙胺（35 ∶65 ∶0．3）作流動相測定甘草酸銨（實際測得峰是甘草酸的峰，再按系數(shù)折算成甘草酸銨，即甘草酸銨的量＝甘草酸的量×1．020 7），結(jié)果未出峰，原因是流動相偏堿性，甘草酸銨無法水解成甘草酸，故最終選擇乙腈－0．017 mol／L磷酸水溶液（35∶65）為流動相。本試驗中選擇230 nm為芍藥苷檢測波長，250 nm為甘草酸銨檢測波長，兩主峰附近均無雜質(zhì)峰干擾，且在這兩波長下靈敏度更高、峰形更佳。

加樣回收試驗：復方芍甘顆粒為中藥制劑，故加樣回收試驗中高、中、低濃度對照品加入量為所測供試品成分量的 1．5，1，0．5 倍，各平行測定 3 份，結(jié)果更科學、可信。