李曉春，王莉芳，鄭 旭，徐長根

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065）

《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》明確提出，國家對醫(yī)療器械按照風(fēng)險(xiǎn)程度實(shí)行分類管理。第一類是風(fēng)險(xiǎn)程度低，實(shí)行常規(guī)管理可以保證其安全、有效的醫(yī)療器械；第二類是具有中度風(fēng)險(xiǎn)，需要嚴(yán)格控制管理，以保證其安全、有效的醫(yī)療器械；第三類是具有較高風(fēng)險(xiǎn)，需要采取特別措施嚴(yán)格控制管理，以保證其安全、有效的醫(yī)療器械。根據(jù)2017年8月頒布的《醫(yī)療器械分類目錄》，鼻腔黏膜修復(fù)敷料屬于無源植入器械中的組織工程支架材料，屬Ⅲ類醫(yī)療器械。本研究中按照GB／T系列標(biāo)準(zhǔn)對3批鼻腔黏膜修復(fù)敷料進(jìn)行了細(xì)胞毒性、遲發(fā)型過敏及刺激等生物學(xué)評價［1－4］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

材料、藥品與試劑：鼻腔黏膜修復(fù)敷料分別選擇3個不同廠家生產(chǎn)的，每個廠家各選1批，共3批，記為A，B，C批。高密度聚乙烯（批號為K0M357，符合美國藥典標(biāo)準(zhǔn)）；氯化鈉注射液（批號為160130 3G，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司）；優(yōu)級胎牛血清（批號為TBD21HY，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；RPMI培養(yǎng)基（批 號 為 AB10125297，HyClone）；青 鏈 霉 素混合液（100 ×，批號為 20170503，Solarbio）；胰蛋白酶（批號為SLBP8607V，Sigma）；無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，批號為05E16B21，武漢博士德生物工程有限公司）；濾器（0．22 μm，批號為 R6EA47847，Millipore）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，批號為20171114，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT，批號為 MKBN7264V，Sigma）。

細(xì)胞及動物：細(xì)胞株［小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞），編號為CX0187，武漢博士德生物工程有限公司］；白化豚鼠（Dunkin Hartley）、新西蘭兔，均由西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為 SCXK（陜）2014－001。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26℃，相對濕度40% ～70%，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK（陜）2013－001，均由陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院實(shí)驗(yàn)動物管理委員會按照該院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會章程批準(zhǔn)實(shí)施。

儀器：BS2202S型電子天平（賽多利斯儀器有限公司）；BSP－250型生化培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KA－1000型低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SW－CJ－2F型醫(yī)用凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；HF151型CO2培養(yǎng)箱（上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司）；XSZ－D2型倒置相差顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；Versa Max0310－3264型酶標(biāo)儀（美國分子儀器有限公司）；LDZF－50KB－Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1．2 方法

1．2．1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗(yàn)［1，5］

健康、初成年普通級白化豚鼠，雌雄不限，體質(zhì)量300～500 g，35只。30 只作為試驗(yàn)組（A，B，C 組），每個樣品10只；5只作為對照組。試驗(yàn)前，剔除豚鼠背部被毛。

誘導(dǎo)階段：試驗(yàn)組用吸收性紗布浸透供試品原液1 mL，局部貼敷于每只動物的左上背部位。6 h后除去包扎帶和紗布。1周中連續(xù)3 d重復(fù)該步驟，同法操作3周。對照組以0．9%氯化鈉注射液同法操作。

激發(fā)階段：最后1次誘導(dǎo)貼敷后14 d，用供試品和0．9%氯化鈉注射液對全部動物進(jìn)行激發(fā)。方法同上，貼敷于每只動物去毛的未試驗(yàn)部位。6 h后除去包扎帶和紗布。

動物觀察：激發(fā)后24 h剃去激發(fā)部位及其周圍的被毛，溫水洗凈，擦干。脫毛后至少2 h，按Magnusson和Kligman分級對試驗(yàn)部位評分，其中無明顯改變?yōu)?級，散發(fā)性或斑點(diǎn)狀紅斑為1級，中度融合性紅斑為2級，重度紅斑和水腫為3級。并在除去紗布后48 h進(jìn)行再次評分。

1．2．2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT 法）［2－4，6］

試驗(yàn)樣品及試液制備：無菌條件下將鼻腔黏膜修復(fù)敷料與含血清培養(yǎng)基按0．2 g／mL的比例于37℃浸提24 h后 2000r／min 離心 5 min，取上清液，得供試液。取高密度聚乙烯（厚度為1 mm）36 cm2，剪成5 mm×25 mm的小塊，加12 mL細(xì)胞生長培養(yǎng)液，37℃浸提24 h，過濾除菌，得陰性對照液。5%的DMSO溶液，過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配，得陽性對照液。同細(xì)胞生長培養(yǎng)液，得空白對照液。

細(xì)胞懸液制備：將已培養(yǎng)48～72 h生長旺盛的細(xì)胞用消化液消化后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，吸管吹打，混勻，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞密度，C＝ n／4×104，式中 C為細(xì)胞密度，單位為個 ／mL；n為計(jì)數(shù)板四角四大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，單位為個。根據(jù)實(shí)測細(xì)胞密度，加入適量細(xì)胞生長培養(yǎng)液配制成試驗(yàn)要求密度的細(xì)胞懸液，備用。

方法：將配制好的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和供試品組（A，B，C組），每組各設(shè)至少6孔，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液。置CO2培養(yǎng)箱（含體積分?jǐn)?shù)5%CO2氣體）37℃培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液。空白對照組加入新鮮空白對照液，陰性對照組加入陰性對照液，陽性對照組加入陽性對照液，供試品組加入相應(yīng)的供試液，每孔100 μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h后置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g／L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm和630nm波長下測定吸光度，按公式計(jì)算相對增殖率（RGR）。RGR＝A／A0×100%，式中 RGR為相對增值率（%），A為供試品組（陽性及陰性對照組）吸光度，A0為空白對照組吸光度。RGR按細(xì)胞毒性反應(yīng)分級判定毒性反應(yīng)分級，0級相對增殖率≥100%，1級相對增殖率為80% ～99%，2級相對增殖率為50% ～79%，3級相對增殖率為30% ～49%，4級相對增殖率為0～29%。

1．2．3 黏膜刺激試驗(yàn)［1］

取健康、初成年普通級新西蘭兔，雌雄不限，體質(zhì)量不低于2 kg。選取鼻腔無明顯刺激癥狀、無缺陷和無損傷的家兔12只，供試品組（A，B，C組）和對照組各3只。供試品組將受試物原液0．3 g涂抹至鼻腔內(nèi)，24 h內(nèi)不沖洗，對照組以0．9%氯化鈉注射液0．5 mL同法處理。每隔24 h重復(fù)上述操作，連續(xù)14 d。觀察記錄鼻腔黏膜刺激情況。末次接觸后24 h，無痛處死動物，解剖鼻腔組織，縱向切開，肉眼觀察黏膜組織的刺激情況。選取中央部位，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色，LEICA生物顯微鏡觀察［7］。按表1規(guī)定的計(jì)分系統(tǒng)對組織進(jìn)行評分。試驗(yàn)組動物顯微鏡評價計(jì)分相加后再除以觀察總數(shù)即得試驗(yàn)組平均計(jì)分，最大計(jì)分為16分，對照組同法計(jì)算。試驗(yàn)組平均計(jì)分減對照組平均記分即得刺激指數(shù)。刺激指數(shù)0分為無反應(yīng)，1～4分為反應(yīng)程度極輕，5～8分為反應(yīng)程度輕度，9～11分為反應(yīng)程度中度，12～16分為反應(yīng)程度重度。

表1 鼻腔黏膜組織反應(yīng)顯微鏡計(jì)分系統(tǒng)（分）

2 結(jié)果

2．1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

于激發(fā)后24 h及48 h觀察，供試品組及對照組中豚鼠的反應(yīng)等級均為0，表明3批鼻腔黏膜修復(fù)敷料在本試驗(yàn)條件下對豚鼠皮膚無致敏反應(yīng)。結(jié)果見表2。

2．2 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表3。在本試驗(yàn)室條件下，陽性對照組細(xì)胞毒性反應(yīng)級別為3級，陰性對照組細(xì)胞毒性反應(yīng)級別為0級，試驗(yàn)系統(tǒng)有效。3批鼻腔黏膜修復(fù)敷料的細(xì)胞毒性反應(yīng)級別均不大于2級，在標(biāo)準(zhǔn)可接受范圍內(nèi)。

表3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

2．3 黏膜刺激性試驗(yàn)結(jié)果

病理檢查結(jié)果顯示，對照組黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層可見極少量炎性細(xì)胞浸潤，少數(shù)血管充血及極輕度水腫，平均計(jì)分為2．33分；試驗(yàn)組黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層可見極少量炎性細(xì)胞浸潤，輕度血管充血及極輕度水腫，試驗(yàn)組A批平均計(jì)分為4．0分，平均刺激指數(shù)為1．67；試驗(yàn)組B批平均計(jì)分為5．33分，平均刺激指數(shù)為3．0；試驗(yàn)組C批平均計(jì)分為4．67分，平均刺激指數(shù)為2．33。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)室條件下，3批鼻腔黏膜修復(fù)敷料均有極輕度黏膜刺激，病理檢查結(jié)果見圖1，反應(yīng)計(jì)分及程度見表4。

圖1 各組家兔鼻腔黏膜組織HE染色圖（×100）

表4 黏膜刺激性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

隨著鼻內(nèi)鏡手術(shù)技術(shù)的提高和普及，鼻科學(xué)的發(fā)展進(jìn)入了一個新時代，成為治療鼻疾病的主要手段之一。在提高治愈率的同時，術(shù)后填塞、止血、修復(fù)材料的選擇也至關(guān)重要，成為近年來鼻科學(xué)研究的發(fā)展方向［8］。本研究中的鼻腔黏膜修復(fù)敷料的主要成分是甲殼素［Chitin，（1，4）－2－乙酰氨基 －2－脫氧 －β－ D－葡萄糖］，是自然界中除纖維素外含量最豐富的天然多糖，也是除蛋白質(zhì)外含量最豐富的含氮高分子，也是宇宙中唯一帶正電的陽性食物纖維，被科學(xué)界譽(yù)為“第六生命要素”，被歐美國家認(rèn)定為機(jī)能性免疫物質(zhì)［9］?；A(chǔ)研究表明，甲殼素具有良好的生物相容性和生物可降解性，同時還具有促進(jìn)傷口愈合、抗菌抗感染、止痛止血［10］，促進(jìn)人體皮膚細(xì)胞（特別是角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）的生長調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)機(jī)體免疫、體內(nèi)可降解等優(yōu)點(diǎn)［11］。鼻腔黏膜修復(fù)敷料為水凝膠，柔軟、彈性好［12］，可與傷口更有效、嚴(yán)密接觸，能吸收大量傷口滲液，為傷口提供良好的濕潤環(huán)境，且不會造成敷料與創(chuàng)面之間的積液，更益于傷口愈合［13］。本研究中按照 GB／T16886及 GB／T14233的系列標(biāo)準(zhǔn)，對3批鼻腔黏膜修復(fù)敷料進(jìn)行了生物安全性評價，結(jié)果顯示，無豚鼠皮膚致敏反應(yīng)，對家兔鼻腔黏膜僅有極輕度刺激，細(xì)胞毒性不大于2級，均在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的可接受范圍內(nèi)。初步認(rèn)為3批鼻腔黏膜修復(fù)敷料毒性較低，有望用于臨床。