林 美 ，余愛明 ，沈 曉 ，孟英姣 ，鄭華珠 ，王利勝 △

（1．廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006； 2．廣州市醫(yī)藥職業(yè)學校，廣東 廣州 510430）

黃芪桂枝五物湯出自張仲景《金匱要略》，由黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗組方，在中醫(yī)辨證的基礎(chǔ)上可加減運用于風濕骨病、糖尿病并發(fā)癥、中風后遺癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、胃病、皮膚病，以及婦科、兒科等疾?。?－2］。方中黃芪為君藥，桂枝、白芍為臣藥，主要有效成分有毛蕊異黃酮葡萄糖苷［3］、桂皮醛［4］和芍藥苷［5］。臨床多用水煎劑，影響有效成分煎出的是煎煮時間，但臨床關(guān)于煎煮時間長短的說法較籠統(tǒng)。各成分協(xié)調(diào)作用保證療效，但各成分的化學性質(zhì)不同，故煎煮時間會影響有效成分的含量及比例，從而影響療效［6－7］。本研究中探討了第1次煎煮和復(fù)煎過程黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍藥苷溶出率－時間的關(guān)系，同時建立了動力學方程，為臨床用藥和制劑工藝研究提供了依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

SKM型數(shù)顯恒溫電熱套（山東鄄城光明儀器有限公司）；高效液相色譜儀，包括P680型二元泵，ASI－100型自動進樣器，DAD－3000型檢測器，變色龍色譜工作站（美國戴安公司）；AΜW120D型電子天平（十萬分之一，日本島津公司）。

1．2 試藥

黃芪 Astragalus mongholicus Bunge．，桂枝 Cinnamomum cassia Presl，白芍 Paeonia lactiflora Pall．，生姜 Zingiber officinale Rosc．，大棗 Ziziphus jujuba Mill．，均為市售品，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院張丹雁教授鑒定為正品；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，批號為170502）；芍藥苷對照品（成都克洛瑪生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，批號為CHB161227）；桂皮醛對照品（成都克洛瑪生物技術(shù)有限公司，純度≥98%，批號為CHB171009）。乙腈（迪馬科技有限公司，色譜純）；甲酸（科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；超純水（廣州中醫(yī)藥大學自制）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 各有效成分的總含量測定

按照2015年版《中國藥典（一部）》黃芪、桂枝和白芍的有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍藥苷規(guī)定方法進行提取和含量測定，結(jié)果3種成分的含量分別為 0．45%，2．68% ，7．19% ，均符合藥典要求。

2．2 煎煮過程各有效成分含量測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Uranus C18柱（150 mm ×4．6 mm，5 μm）；柱溫：室溫；流動相：乙腈（A）－0．2% 甲酸（B），梯度洗脫（0～20 min時 20%A→40%A，20～30 min時 40%A）；流速：1 mL ／min；檢測波長：285 nm；進樣量：10 μL。

2．2．2 方法學考察

標準曲線制備：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍藥苷對照品適量，精密稱取，加甲醇溶解定容至2 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度分別為 0．580，2．665，1．070 g ／L的貯備液，分別精密吸取系列貯備液適量，置10 mL容量瓶中，甲醇定容，得系列梯度溶液。按擬訂色譜條件進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍藥苷回歸方程分別為 Y ＝0．281X ＋0．139 5（r＝0．999 9），Y＝0．6491X＋48．818（r＝0．9990），Y＝0．009X＋0．0298（r＝0．999 9）；線性范圍分別為 5．02 ～150．51 μg／mL，53．30 ～ 1 066．00 μg ／mL，26．48 ～ 794．48 μg ／mL。

精密度試驗：取中間質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)測定6次。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍藥苷峰面積的 RSD分別為1．10%，1．08%，1．25%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品，煎煮過程中于同一時間平行取樣6份，制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍藥苷含量的 RSD分別為 4．64% ，0．40% ，4．14% （n ＝ 6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液適量，于4℃保存，分別于 0，1，2，4，6，8 h 時測定。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍藥苷含量的 RSD分別為 4．07%，0．17% ，1．28% （n＝6），表明供試品溶液在 4 ℃保存8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量有效成分的供試品0．5 mL，共6份，分別精密加入適量毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍藥苷對照品溶液，純水定容至2 mL，進樣分析，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芪桂枝五物湯中3種有效成分的加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2．3 煎煮過程各有效成分的動力學模型研究

2．3．1 繪制溶出度曲線

稱取處方量藥材（組方：黃芪9 g，桂枝9 g，白芍9 g，生姜18 g，大棗4枚），置1 000 mL三口燒瓶中，加入10倍量純水，浸泡2 h，回流提取，從沸騰開始計時，煎煮2 h，過濾，濾渣加入8倍量純水，復(fù)煎2 h。2次煎煮過程中，定時取煎煮液 1 mL，分別于 0，10，20，40，60，80，100，120 min時取樣，取樣后補加等量同溫度的純水，繼續(xù)煎煮。煎煮液于3 000 r／min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，過0．22 μm濾膜，按擬訂色譜條件測定含量，計算溶出率［溶出率＝（煎煮液中有效成分的量／有效成分總量）×100%］。平行重復(fù)試驗3次，以平均溶出率繪制溶出率曲線，詳見圖1。

可見，2次煎煮過程中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芍藥苷的累積溶出率總體隨時間增加而增加，煎煮時間越長，溶出越多。毛蕊異黃酮葡萄糖苷最大溶出率分別為15．18%和 1．41%，2次煎煮最大累積溶出率為16．59%，說明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在水中不易溶出；芍藥苷最大溶出率分別為51．94%和5．55%，其溶出規(guī)律與毛蕊異黃酮葡萄糖苷相似，煎煮過程中含量不斷波動，可能是由于苷類物質(zhì)在加熱過程中分解成苷元，導致含量減少，之后成分溶出的增加占主導作用，含量增大，提示苷類物質(zhì)需要較長的煎煮時間，以保證有效成分的溶出。2次煎煮過程中，桂皮醛的溶出率隨著時間的增加，先增大后減少。第1次煎煮時，30 min內(nèi)桂皮醛含量增加了近30%，達到82．46%，提示桂皮醛在水煎煮過程中能迅速溶出，且溶出較充分，30 min后含量開始不斷降低，提示桂枝不適宜長時間煎煮。

圖1 煎煮過程中各有效成分的溶出率變化

2．3．2 建立動力學方程

采用Datafit 9．1軟件，以時間（t）為自變量、溶出率（Q）為因變量進行擬合，得出溶出率曲線的擬合方程，并采用相關(guān)系數(shù)（r）和 P評價方程擬合度。r越接近1，P＜0．05說明擬合度越好。結(jié)果見表2?？梢姡髂Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)（r）均大于 0．95，且 P ＞ 0．05，說明建立的模型能較好地反映第1次煎煮及第2次煎煮過程中3種有效成分溶出率－時間的關(guān)系。

表2 煎煮過程中3種有效成分溶出率模型擬合結(jié)果

2．3．3 驗證動力學模型

稱取處方量藥材，置1 000 mL三口燒瓶中，加入10倍量純水，浸泡2 h后回流提取，從沸騰開始計時，煎煮2 h，過濾，濾渣加入8倍量純水，復(fù)煎2 h。2次煎煮過程中，定時取煎煮液1 mL，取樣時間分別為6，12，25，42，60，84，114 min，取樣后補加等量同溫度的純水，繼續(xù)煎煮。煎煮液于3 000 r／min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，過0．22 μm濾膜，按擬訂色譜條件測定含量，平行重復(fù)試驗3次，計算平均溶出率。結(jié)果見表3。比較模型預(yù)測值與實測值，第1次和第2次煎煮過程中各取樣時間、實測溶出率和預(yù)測溶出率的相對偏差不超過10．00%，表明該模型能較好地反映煎煮過程中3種有效成分溶出率的變化過程。

表3 煎煮過程3種有效成分溶出率模型實測值和預(yù)測值比較結(jié)果（%）

3 討論

中藥湯劑多為復(fù)方，且所含化學成分復(fù)雜，在煎煮過程中可能會發(fā)生復(fù)雜的物理化學變化，不同成分的溶出比例隨時間而改變，從而影響療效或產(chǎn)生毒副作用。黃芪桂枝五物湯有抗炎鎮(zhèn)痛、增強免疫、保護腦血管、改善腦代謝、減少腦損傷后遺癥等作用［8］，其中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷都有增強免疫和改善心腦血管的功能［9］。本研究中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出率較低，黃芪甲苷在黃芪桂枝五物湯煎煮過程中溶出較多［10］，提示黃芪桂枝五物湯中起主要作用的是黃芪甲苷，而非毛蕊異黃酮葡萄糖苷。桂皮醛有抗炎和神經(jīng)保護作用［11］，由圖1可知，桂皮醛在水煎液中溶出較多，但煎煮30 min后，桂皮醛的含量逐漸減少，可能是煎煮過程中隨水蒸氣揮發(fā)和被空氣氧化所致。2次水煎液同一成分的溶出率相差10倍左右，說明湯劑煎煮2次，取2次煎液混合后服用是有必要的，否則可能會影響血藥濃度。本研究中，由于黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、桂皮醛和芍藥苷化學成分的性質(zhì)不同，煎煮過程溶出規(guī)律有較大差異。目前，通過熵權(quán)法綜合考慮各個指標的影響評價整個提取過程，可靠性好［12］，但是每個指標的重要程度不相同。需要綜合考慮確定黃芪桂枝五物湯中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷哪個是發(fā)揮療效的主要成分，以及臣藥桂枝和白芍中的桂皮醛和芍藥苷的重要程度，并對每個指標賦予權(quán)重，計算綜合評價值，才能更全面地優(yōu)化煎煮時間。