俞立強 陳瑜玨 張樂馳 蔣建華 方琪

作者單位：215000 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

炎性肌病(inflammatory myopathies，IM) 是一組亞急性、慢性或急性獲得性異質(zhì)性肌肉疾病，其共同特點是中至重度的肌無力及炎性細(xì)胞浸潤[1-2]?，F(xiàn)階段根據(jù)IM臨床表現(xiàn)、免疫病理方面、組織學(xué)表現(xiàn)、預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)以及對于治療不同程度的反應(yīng)，將其分為多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(DM)、壞死性肌炎(NAM)及包涵體肌炎(sIBM)四種亞型[3-4]。由于IM的異質(zhì)性、復(fù)雜性和病程的遷延性，IM臨床研究受到多方面的限制。PM是一種慢性自身免疫性肌炎，其主要影響橫紋肌。最主要的發(fā)病機制是免疫學(xué)說，但到目前為止引起異常免疫反應(yīng)的具體抗原仍不清楚。實驗性自身免疫性肌炎(experimental autoimmune myositis，EAM)是研究PM病理機制的重要動物模型，而目前該模型的制作多是以骨骼肌部分純化的肌球蛋白作為抗原[5-8]。作為抗原的骨骼肌可以來源于兔、豚鼠以及人等不同物種。通過注射同種或異種部分純化的肌球蛋白可以在大鼠、小鼠、豚鼠和兔等動物誘發(fā)肌炎。近幾年日本學(xué)者采用純化的肌球蛋白結(jié)合蛋白C(myosin-binding protein C，MyBP C)以及百日咳毒素、完全弗氏佐劑對B6小鼠進行背部、足趾等多點注射進行免疫，成功制作了EAM小鼠模型[9]；且相比之下， MyBP-C2所誘發(fā)制作的模型組織病理學(xué)改變更為嚴(yán)重。本文作者嘗試用MyBP-C2誘導(dǎo)出以CD8+T細(xì)胞炎性滲出為特征的EAM小鼠模型，為后續(xù)的一系列研究奠定基礎(chǔ)。因此，本研究構(gòu)建載體所表達的MyBP-C2作為IM動物模型的重要免疫誘導(dǎo)物，對于IM、PM的發(fā)病機制研究、未來靶向性治療PM的研究方向有著重要的意義。本研究擬通過構(gòu)建MyBP-C2原核表達載體 pET28a-MYBP-C2，進而純化制備得到融合蛋白，期望為后續(xù)所需要構(gòu)建的IM實驗動物模型提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料pET28a(Novagen公司)，限制性內(nèi)切酶(Fermentas公司)，marker(Zoonbio公司)，四甲基乙二胺(TEMED，Thermo Fisher公司)、 Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean Ⅱ垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，Tyrptone、Yeast Extract(OXOID公司)， PCR 反應(yīng)管(Fisher 公司)， Agarose(上海基因公司)，DNA 膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(AXYGEN公司)。Allegra 21R臺式高速冷凍離心機(BECKMAN公司)，臺式高速離心機(SORVAL公司)，PTC-200基因擴增儀(MJ Research 公司)，320-S pH 計(Mettler Toledo 公司)，AR5120 電子天平(AHOM S公司)，MultiTemp Ⅲ恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀(Amersham Pharmacia公司)，雪花狀制冰機(SANYO公司)，JY92-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(中國新芝科技研究所)，超凈工作臺(中國蘇凈集團)。

1.2方法

1.2.1目的基因的擴增：以人骨骼肌cDNA為模板，用F、R引物進行PCR擴增獲得目的基因。參照GeneBank收錄的人骨骼肌MyBP-C2的基因序列，設(shè)計MyBP-C2蛋白編碼基因的PCR引物，然后在5′端引入NcoⅠ酶切位點，3′端引入XhoⅠ酶切位點。上游引物MYBPC2NcoIF(F引物)：5′-ATATCCCATGGGCGACCTGACCCTCAAGTGG TTC-3′，下游引物MyBP-C2XhoIR(R引物)：5′-ATATCCTCGAGCAGCCAGGTAGCGACGGG AGG-3′。反應(yīng)體系：2.5 mmol/L dNTP mixture 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Human MYBPC2 cDNA 0.1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Pfu高保真DNA聚合酶1 μL，ddH2O 41.9 μL。PCR的反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環(huán)25次，最后于72 ℃延伸5 min。使用1%瓊脂糖膠對PCR產(chǎn)物進行電泳分離，并進行切膠回收純化。PCR擴增所得到MyBP-C2片段約為891 bp大小。

1.2.2表達載體的構(gòu)建及鑒定：將目的基因的片段與pET28a質(zhì)粒相連接，并篩選出陽性表達目的基因的質(zhì)粒。分別將回收純化的MyBP-C2目的基因片段和pET28a(+)質(zhì)粒作NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切反應(yīng)，37℃反應(yīng)2 h。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在近1000 bp處可見一條特異性條帶，酶切產(chǎn)物在l%瓊脂糖凝膠中電泳，回收目的片段，作下一步的連接反應(yīng)。 于16℃在T4 DNA Ligase酶作用下反應(yīng)2 h，獲得連接產(chǎn)物pET28a-MYBP-C2基因片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中，將大腸桿菌BL21(DE3)菌液均勻涂布于含50 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。取菌液以PCR法鑒定含有目的基因的陽性克隆，PCR產(chǎn)物以含溴化乙啶(EB)的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像。挑取陽性克隆，提取重組質(zhì)粒pET28a-MYBPC2，經(jīng)NcoⅠ與XhoⅠ雙酶切后，對插入片段的DNA測序鑒定。采用BLAST分析，與Genebank中公布的MYBP-C2序列進行比對。測序由江蘇省弗泰生物科技有限公司完成。

1.2.3融合蛋白的表達：將構(gòu)建好的表達質(zhì)粒pET28a-MYBP-C2轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達菌，挑取陽性單菌落接種于4 mL含氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1︰100比例擴大培養(yǎng)，于37℃以220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，使其D(λ)600mmol/L達到0.4～0.8，加入異丙基硫代半乳糖(IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L，于25℃以180 r/min振蕩培養(yǎng)5 h。于4 ℃以8000 r/min離心3 min后收集菌體，超聲裂解以破碎細(xì)胞。裂解后，以12 000 r/min離心5 min，取上清進行SDS-PAGE電泳，分析各層析組分。用BL2l(DE3)pET28a空載體作為對照，分別對上清、沉淀、對照進行了SDS-PAGE電泳。目的蛋白相對分子質(zhì)量約32 700，與His標(biāo)簽融合表達后相對分子質(zhì)量約為37 500。目的蛋白在上清和沉淀中均有表達，沉淀中表達量較高。

1.2.4融合蛋白的純化：將已轉(zhuǎn)化有pET28a-MYBP-C2表達質(zhì)粒的BL21(DE3)表達菌，接種陽性選擇的單菌落于4 mL含氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1︰100比例擴大培養(yǎng)，于37℃以220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，使其DOD600mmol/L達到0.4～0.8，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，離心收集細(xì)菌，超聲裂解，離心取上清，分別加人1 mL能夠結(jié)合帶His標(biāo)簽?zāi)康牡鞍椎腘i-NTA beads，進行層析純化，洗脫樣品進行SDS-PAGE電泳分離、洗脫，用離心過濾方法濃縮，乙醇沉淀，重復(fù)洗滌去除內(nèi)毒素，得到純化的MyBPC2融合蛋白。

2 結(jié)果

2.1目的基因擴增及表達載體的構(gòu)建及鑒定PCR擴增得到891bp的產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在近1000 bp處可見一條特異性條帶，大小與預(yù)期一致，表明PCR已成功擴增MyBP-C2目的片段。

測序結(jié)果BLAST分析，插入片段的序列與Genebank中公布的序列完全一致(測序圖譜省略)。這表明基因MYBP-C2已成功克隆至原核表達載體pET28a中，重組質(zhì)粒pET28a-MYBP-C2構(gòu)建成功。

注：M：DNA Marker；1，4-8：陽性克隆(即MyBP-C2的PCR產(chǎn)物)；2、3：陰性克隆 圖 1 PCR擴增所得MyBP-C2片段

2.2融合蛋白的表達與純化結(jié)果顯示，融合蛋白條帶大小在34 000～43 000之間(圖2)，表明已成功純化得到目的蛋白。經(jīng)純化最終得到濃度為0.679 g/L的融合蛋白7.18 mg(圖3)。

圖 2 重組pET28a-MYBP-C2融合蛋白的表達(中間黑框為目的蛋白)

注：M：DNA Marker；1：上樣；2：流出；3：50 mmol/L 咪唑1；4：50 mmol/L咪唑2；5：100 mmol/L 咪唑；6：150 mmol/LM 咪唑；7：250 mmol/L 咪唑；8：500 mmol/L 咪唑 圖 3 BL21(DE3)-pET28a-MYBPc2融合蛋白的純化。其中目的蛋白以150 mmol/L咪唑洗脫獲得較高純度蛋白

3 討論

本實驗在國內(nèi)外學(xué)者及專家研究的基礎(chǔ)上改進了MyBP-C2融合蛋白的表達和純化體系且獲得了良好的結(jié)果。

現(xiàn)對于IM的研究模型使用最多的為EAM，它是由肌勻漿或部分純化的肌球蛋白免疫SJL/J小鼠獲得的IM模型[8-9]。這種模型是PM的復(fù)雜表現(xiàn)，因為SJL/J小鼠有dysferlin基因變異從而導(dǎo)致自發(fā)性肌肉壞死和繼發(fā)的肌肉炎性反應(yīng)[10]。免疫組化研究已經(jīng)顯示壞死肌肉中的主要浸潤細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞，這表明EAM動物模型是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)[11]。而現(xiàn)有研究表明，PM的發(fā)病機制是由以CD8+T細(xì)胞為主介導(dǎo)的細(xì)胞免疫導(dǎo)致，故需要一個更加符合PM發(fā)病機制的EAM動物模型以進行相關(guān)研究。

肌球蛋白結(jié)合蛋白C(myosin-binding protein C，MyBP-C或C-protein)位于橫紋肌肌原纖維A帶的橫橋承載區(qū)[12-13]，可用于介導(dǎo)新型動物模型[7]。生物化學(xué)純化研究顯示MyBP-C是利用Lewis大鼠誘導(dǎo)實驗性肌炎動物模型時的原始骨骼肌肌球蛋白中的主要免疫成分[14-15]。肌小節(jié)是肌肉執(zhí)行收縮功能的基本單位，有粗肌絲和細(xì)肌絲之分，包括MyBP-C、肌球蛋白結(jié)合蛋白H(MyBP-H)、肌球蛋白結(jié)合蛋白X(MyBP-X)等幾種形式。其中MYBP-C只存在于橫紋肌組織中。MYBP-C2是人肌球蛋白結(jié)合蛋白C的成員之一，這個家族還包括肌球蛋白結(jié)合蛋白C1(慢型)和C3(心肌型)[16]。MyBP-C相對分子質(zhì)量為140 000，一級結(jié)構(gòu)含1411個氨基酸殘基，包含7個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，3個3型纖連蛋白，以及1個肌球蛋白結(jié)合蛋白基本序列[17]。MyBP-C2通過和肌球蛋白絲和肌動蛋白絲之間的相互作用，對粗肌絲的正確裝配和穩(wěn)定、調(diào)節(jié)橫橋的形成和肌纖維的收縮起著重要作用[15，18]。

日本學(xué)者將MyBP-C2的基因與組氨酸(His)標(biāo)簽的PQE-30質(zhì)粒連接形成重組基因并進行表達，再用鎳柱純化所表達的融合蛋白[7]。本實驗前期也曾采用pQE-30質(zhì)粒作為表達載體，表達質(zhì)粒pQE-30-MyBP-C2構(gòu)建成功，但在不同溫度、不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)時間下，目的蛋白均沒有得到成功表達；之后本文作者研究團隊改用PET-28a載體對MyBP-C2蛋白進行原核表達。萬娟等[19]的研究表明，pET-28a載體是經(jīng)改造優(yōu)化的帶有His標(biāo)簽的原核表達載體，具有可溶性表達效率高、分離純化簡單等特點，使用了此載體，并對溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度以及誘導(dǎo)時間等相關(guān)條件進行摸索，確定了融合蛋白的表達條件并成功獲得了融合蛋白。

目前國內(nèi)張寅麗等[20]根據(jù)NCBI公布的人MYBPC2信使RNA序列(Gene ID：4606)，設(shè)計出的引物為：上游引物序列為“5′-GACCTGACCCT.CAAGTGGrrrC-3′”。而本研究中的引物為參照GeneBank收錄的人骨骼肌MyBP-C2的基因序列，設(shè)計出上游引物MYBPC2NcoIF(F引物)：5′-ATATCCCATGGGCGACCTGACCCTCAAGTGG-TTC-3′，下游引物MyBP-C2XhoIR(R引物)：5′-ATATCCTCGAGCAGCCAGGTAGCGACGGG-AGG-3′。由于所用引物的不同，實驗中選取的酶切位點也不相同。在本次實驗研究的融合蛋白純化過程中，利用了多重梯度濃度的咪唑以洗脫，所得蛋白的純度明顯高于張寅麗等[20]的研究中所得到的蛋白純度。

綜上，本實驗成功的擴增了MyBP-C2的全長cDNA，并將其連接至原核表達載體pET28a。確立了 pET28a-MyBP-C2融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件并純化獲得了pET28a-MyBP-C2融合蛋白，為下一步誘導(dǎo)建立新型EAM的動物模型奠定了堅實的基礎(chǔ)，同時為研究自身免疫性肌炎的發(fā)病機制及治療方法等諸多方面提供了新方法。