方勇木

【摘要】 目的：探討胃液轉(zhuǎn)流對(duì)急性壞死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）大鼠血清鈣和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響。方法：將雄性SD大鼠72只按照隨機(jī)數(shù)字表法分為急性壞死性胰腺炎組（ANP組）、胃液轉(zhuǎn)流組（GB組）和對(duì)照組（SO組），每組分12、24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)12只。以5%?；敲撗跄懰徕c逆行胰膽管注射建立ANP模型，GB組在造模前30 min行胃空腸吻合完成胃液轉(zhuǎn)流。觀察各組血清鈣濃度，采用蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blot）分析血清TNF-α變化。結(jié)果：ANP組各時(shí)間點(diǎn)血清鈣濃度較SO組均顯著下降（P<0.01）。GB組血清TNF-α濃度較ANP組顯著下調(diào)（P<0.01），血清鈣濃度較ANP組顯著升高（P<0.01）。結(jié)論：行胃液轉(zhuǎn)流人為曠置十二指腸，結(jié)果ANP大鼠的低鈣血癥回升，血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α明顯下降。

【關(guān)鍵詞】 急性壞死性胰腺炎； 胃液轉(zhuǎn)流； 低鈣血癥； 腫瘤壞死因子-α

【Abstract】 Objective：To investigate the role of gastric bypass in hypocalcaemia and TNF-α of rats with ANP.Method：A total of 72 male health adult SD rats were randomized into three groups：ANP group，ANP treated with Gastric bypass group （GB group），sham operation group（SO group）.Every group was sub-divided into 12，24 h group with 12 rats in each one.ANP model was induced by bili-pancreatic duct retrograde infusion with 5% sodium taurocholate solution.In the GB group，rats were accomplished with Gastric bypass 30 minutes before the induction of ANP model.The Serum calcium was determined，the change of TNF-α was measured by Western blot.Result：The serum levels of calcium in ANP group was lower than that in SO group（P<0.01）.The expression TNF-αin GB group was lower than that in ANP group（P<0.01），the serum levels of calcium was higher than that in ANP group（P<0.01）.Conclusion：The gastric bypass increases the serum levels of calcium and decreases the expression of TNF-α of rats with ANP.

【Key words】 Acute necrotizing pancreatitis； Gastric bypass； Hypocalcaemia； TNF-α

First-authors address：The Third Hospital of Xiamen，Xiamen 361100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.007

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作急性壞死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）大鼠模型，應(yīng)用胃液轉(zhuǎn)流人為曠置十二指腸，干預(yù)ANP大鼠，研究胃液轉(zhuǎn)流對(duì)ANP大鼠低鈣血癥和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 成年雄性SD大鼠72只，體重250～270 g，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，急性壞死性胰腺炎（ANP組）、胃液轉(zhuǎn)流組（GB組）和對(duì)照組（SO組），每組分為制模后12、24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)12只大鼠。

1.2 方法 （1）參照Schmidt等[1]和楊波等[2]方法建立ANP動(dòng)物模型：大鼠制模前12 h禁食，不限制飲水，大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（2 mL/kg）麻醉，固定，腹部皮膚備皮，消毒，自上腹正中劍突下1 cm作約1 cm切口進(jìn)腹，于肝下找到十二指腸，膽胰管肝門端用動(dòng)脈夾夾閉，顯微鏡下操作，將一連接微量推注泵的4?頭皮針頭從膽胰管遠(yuǎn)端逆行穿刺，以0.2 mL/min注射速度逆行推注5%牛磺脫氧膽酸鈉（1.0 mL/kg），保持壓力8 min，注畢即可觀察到胰腺組織廣泛水腫和出血。回納十二指腸，逐層關(guān)腹。大鼠后肢皮下注射生理鹽水10 mL以防脫水。（2）GB組在泵入5%牛磺脫氧膽酸鈉前30 min完成胃液轉(zhuǎn)流術(shù)：取十二指腸與小腸交界處以下5 cm處與胃大彎側(cè)前壁行側(cè)側(cè)吻合，吻合口直徑0.5 cm，胃與十二指腸交界處交鎖縫合，縫閉胃流出道，其他步驟同ANP組。（3）SO組在開腹后，只輕翻動(dòng)胃、十二指腸、空腸及胰腺后關(guān)腹。（4）標(biāo)本收集：各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別再次麻醉、消毒后開腹，下腔靜脈采血8 mL，血液凝固析出血清后，離心分離（3 000 r/min，10 min），測(cè)定血清鈣濃度。

1.3 觀察指標(biāo) （1）血清鈣濃度的測(cè)定采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)。（2）蛋白免疫印跡技術(shù)（western blot）檢測(cè)血清TNF-α表達(dá)量。應(yīng)用蛋白提取試劑盒（Pierce公司）按照說(shuō)明書進(jìn)行蛋白提取，Bradford法進(jìn)行蛋白定量（試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司），按說(shuō)明書進(jìn)行蛋白定量，取20 μg樣品常規(guī)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉，加入TNF-α、β-actin一抗（1∶400，TIANGEN公司）孵育過(guò)夜，洗膜后加入羊抗鼠IgM二抗，于室溫孵育45 min，洗膜后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑，壓片顯影，采用Bandscan軟件分析圖像，目的條帶與β-actin的比值表示各組蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析、t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血清鈣濃度變化比較 SO組中12 h時(shí)間點(diǎn)血清鈣濃度與24 h時(shí)間點(diǎn)血清鈣濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。ANP組各時(shí)間點(diǎn)血清鈣濃度均較SO組顯著下降，GB組在各時(shí)間點(diǎn)血清鈣濃度均較ANP組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 三組血清TNF-α變化比較 SO組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α不表達(dá)。GB組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α的表達(dá)量較均ANP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表2和圖1、2。

3 討論

SAP早期免疫過(guò)激，多種細(xì)胞因子的大量釋放是SAP病情惡化的重要因素之一[3]。細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在SAP發(fā)病過(guò)程中起十分重要的病理、生理作用已為共識(shí)。細(xì)胞因子的釋放情況與病情嚴(yán)重程度及并發(fā)癥的發(fā)生存在密切相關(guān)性。在SAP早期由于胰酶的異常激活，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞的過(guò)度激活并且釋放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子，炎性細(xì)胞因子可刺激粒細(xì)胞使之活化并與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，且進(jìn)一步刺激吞噬細(xì)胞使其功能激活，釋放大量氧自由基（OFR）及過(guò)量炎性介質(zhì)、蛋白酶和水解酶，從而產(chǎn)生瀑布樣炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）的發(fā)生，造成器官損害，進(jìn)一步發(fā)展為多器官功能障礙綜合征（MODS）。低鈣血癥是重癥急性胰腺炎（SAP）常見(jiàn)的重要并發(fā)癥，血清鈣水平的高低與預(yù)后密切相關(guān)，低血鈣程度與病情嚴(yán)重程度成正比。血鈣水平已成為臨床診治中判斷預(yù)后、估計(jì)病情的最重要指標(biāo)之一。臨床上觀察到，當(dāng)SIRS表現(xiàn)不明顯時(shí)，血清鈣不降低或降低不明顯；相反，SIRS表現(xiàn)突出伴有胰外臟器功能不全時(shí)，即使胰周脂肪壞死不顯著，血鈣也顯著降低。血鈣的降低幅度與SIRS的嚴(yán)重程度成正比[4]。因此血鈣水平與細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)量，均反應(yīng)SAP病情的嚴(yán)重程度，Yekebas及其研究小組進(jìn)行了一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)早期有效的清除炎癥介質(zhì)，可改善實(shí)驗(yàn)SAP豬的預(yù)后[5-7]，Dunn等[8]通過(guò)阻止NF-kappa B的活化、抑制細(xì)胞因子TNF基因的表達(dá)，減輕SAP炎癥反應(yīng)，改善SAP預(yù)后。SAP早期應(yīng)用抗腫瘤壞死因子-α單克隆抗體（TNF-α McAb）阻斷TNF-α的表達(dá)，在改善胰腺病理變化、降低血淀粉酶的同時(shí)也改善了血鈣水平[9]。

因此通過(guò)抑制細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的生成，可減輕SAP的炎癥反應(yīng)，降低SAP血鈣水平，改善SAP的預(yù)后。

促胰液素是刺激胰液分泌的最強(qiáng)刺激物，而十二指腸的pH值是促胰液素釋放的最主要因素，生理性的胃酸即可引起血中促胰液素的升高，pH值4.5為閾值；流入十二指腸的胃酸促進(jìn)促胰液素酶的釋放，是胰腺外分泌增加的主要因素，由于十二指腸酸性化，在胰酶分泌增加的同時(shí)，血中膽囊收縮素亦升高，胃酸不僅促進(jìn)促胰液素酶的釋放，也促進(jìn)膽囊收縮素的釋放；抑制胃酸的分泌能抑制促胰液素的釋放，間接抑制胰液的分泌[10-12]。文獻(xiàn)[13-15]的研究結(jié)果表明注鹽酸入十二指腸能強(qiáng)烈刺激促胰液素的釋放，使胰酶分泌增加；陳元方[16]研究表明，酸化十二指腸可引起胰蛋白酶分泌量增可，兩者呈量效關(guān)系，酸化十二指腸可引起膽囊收縮素（CCK）分泌量增加，CCK的增加量與進(jìn)入十二指的酸量呈正相關(guān)。SAP時(shí)，胰腺外分泌受刺激增強(qiáng)，胰蛋白酶大量分泌，加重胰腺自身消化，包括胰周組織的消化及胰外器官損害加重，引起病情惡化，理論上胰腺外分泌減少，胰蛋白酶減少，減少胰腺自身消化，進(jìn)而減輕急性胰腺炎炎癥程度，“胰腺休息”理論是SAP治療的基礎(chǔ)，即減少和抑制胰腺的外分泌，盡可能地減輕胰液對(duì)胰腺和胰周組織的損傷。多數(shù)學(xué)者研究證實(shí)，曠置胃和十二指腸減少胃酸分泌和反射性調(diào)節(jié)機(jī)制是保證胰腺休息的重要因素[17]，臨床上發(fā)現(xiàn)SAP時(shí)經(jīng)空腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不但不增加胰腺的負(fù)擔(dān)，反而減少腸源性感染的并發(fā)癥，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力[18-19]。有研究報(bào)道，完成胃空腸吻合術(shù)行胃液轉(zhuǎn)流的SD大鼠，其含脂肪的組織TNF-α mRNA水平較對(duì)照組明顯下降[20]。屈新才等[21]報(bào)道對(duì)于需要手術(shù)治療的急性胰腺炎并發(fā)十二指腸梗阻患者，行迷走神經(jīng)干切斷加胃空腸吻合取得良好的療效。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)行胃液轉(zhuǎn)流，人為曠置十二指腸，使得胃酸、胃蛋白酶等胃液不經(jīng)過(guò)十二指腸，去除了胃液對(duì)十二指腸的直接刺激，使胃液直接進(jìn)入空腸，此方式去除了胃液胃酸對(duì)十二指腸的直接刺激，結(jié)果ANP大鼠的低鈣血癥回升，血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α明顯下降。因此筆者推測(cè)胃液轉(zhuǎn)流可能可減少促胰液素及膽囊收縮素釋放，使胰液特別是胰蛋白酶分泌及細(xì)胞因子釋放減少，減輕SAP的炎癥反應(yīng)，改善SAP的預(yù)后，其中具體機(jī)制及能否減輕急性胰腺炎的炎癥程度和能否改善急性壞死性胰腺炎的預(yù)后，值得進(jìn)一步深入探討。

參考文獻(xiàn)

[1] Schmidt J，Rattner D W，Lewandrowski K，et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J].Ann surgery，1992，215（1）：44-56.

[2]楊波，黃鶴光，陳大良，等.逆行性胰膽管注射法制作重癥急性胰腺炎大鼠模型[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，36（1）：71-72.

[3] McKay C J，Gallagher G，Brooks B，et al.Increased monocyte cytokine production in association with systemic complications in acute pancreatitis[J].Br J Surg，1996，83（7）：919-923.

[4]黃鶴光，陸逢春.急性胰腺炎低鈣血癥與細(xì)胞因子[J].腹部外科.2005，18（4）：207-208.

[5] Yekebas E F，Treede H，Knoefel W T，et al.Influence of zero-balanced hemofiltration on the course of severe expeirmental pancreatitis in pigs[J].Ann Surg，1999，229（4）：514-522.

[6] Yekebas E F，Eisenberger C F，Ohnesorge H，et al.Attenuation of sepsis-related immunoparalysis by continuous veno-venous hemofiltration in experimental porcine pancreatitis[J].Crit Care Med，2001，29（7）：1423-1430.

[7] Yekebas E F，Strate T，Zolmajd S，et al.Impact of different modalities of continuous venovenous hemofiltration on sepsis-induced alterations in experimental pancreatitis[J].Kidney Int，2002，62（5）：1806-1818.

[8] Dunn J A，Li C，Ha T，et al.Therapeutic modification of nuclear factor（kappa）B binding activity and tumor necrosis factor-alpha gene expression during acute biliary pancreatitis[J].Am surg，1997，63（12）：1036-1043.

[9]陸逢春，黃鶴光.重癥急性胰腺炎腫瘤壞死因子-α與低鈣血癥的關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22（4）：397-398.

[10]呂云福.現(xiàn)代胰腺外科學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：121-133.

[11]沈魁，鐘守先，張圣道.胰腺外科[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：241-349.

[12]朱大年，吳博成，樊小力.生理學(xué)[M].7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：164-192.

[13] Wang C C，Grossman M I.Physiological determination of release of secretin and pancreozymin from intestine of dogs with transplanted pancreas[J].Am J Physiol，1951，164（2）：527-545.

[14] Meyer J H，Spingola J Grossman M I.Endogenous cholecystokinin potentiates exogenous secretin on pancreas of dog[J].Am J Physiol，1971，221（3）：742-747.

[15] Falk G W，Chey W Y，Owyang C.Secretin as a physiological modulator of interdigestive gastric motility in man[J].Gastroenterology，1986，90（5）：1410.

[16]陳元方.酸化十二指腸可釋放膽囊收縮素[J].生理科學(xué)，1986，6（1）：26-29.

[17] Ragins H，Levenson S M，Signer R，et al.Intrajejunal administration of an elemental diet at neutral pH avoids pancreatic stimulation：studies in dog and man[J].Am J Surg，1973，126（5）：606-614.

[18] Windsor A C，Kanwar S，Li A G，et al.Compared with parenteral nutrition，enteral feeding attenuates the acute phase response and improves disease severity in acute pancreatitis[J].Gut，1998，42（3）：431-435.

[19] Kalfarentzos F，Kehagias J，Mead N，et al.Enteral nutrition is superior to parenteral nutrition in severe acute pancreatitis：results of a randomized prospective trial[J].Br J Surg，1997，84（12）：1665-1669.

[20] Rideout，Drew A，Peng，et al.Roux-en-Y gastric bypass alters tumor necrosis factor-alpha but not adiponectin signaling in immediate postoperative period in obese rats[J].Surgery for Obesity and Related Diseases，2010，6（6）：676-680.

[21]屈新才，肖谷欣，鄭啟昌，等.急性胰腺炎并發(fā)十二指腸梗阻的外科治療[J].中國(guó)普通外科雜志，2002，11（3）：189.