劉倩，張敏敏，李圣波，梁琰,3，劉偉，程素盼,4，王曉，耿巖玲，趙恒強(qiáng)*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；2.青海亞特生物科技有限公司，青海 西寧 810000；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 27101834.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬(LonicrajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花，為藥食兼用型植物。其性寒味甘，歸肺、心、胃經(jīng)，屬清熱解毒、疏散風(fēng)熱之要藥[1-3]。作為常用中藥，金銀花在我國流通及使用的品種復(fù)雜多樣?！皝喬匾惶枴绷挤N金銀花，為山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司以我國立本大葉金銀花中產(chǎn)生的自然優(yōu)良系株為基本，與美國優(yōu)良品系金銀花進(jìn)行雜交，再經(jīng)無性繁殖等方法；栽種、培育而成的系列新品種。該品種具有抗逆性強(qiáng)、耐旱、耐澇、耐寒熱、耐土壤瘠薄，抗病性強(qiáng)，易繁殖，根系發(fā)達(dá)等優(yōu)勢，有非常高的藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4-7]。本實(shí)驗(yàn)研究對象即為在西藏產(chǎn)區(qū)種植的“亞特一號”良種金銀花?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花中含有有機(jī)酸、黃酮、環(huán)烯醚萜苷等復(fù)雜的化學(xué)成分，具有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、利尿和降低膽固醇等作用[8-12]。2015版《中國藥典》[13]中僅以綠原酸和木犀草苷兩個(gè)指標(biāo)對金銀花進(jìn)行質(zhì)量控制，具有較大的局限性。高效液相色譜技術(shù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品指認(rèn)方法，能夠?qū)χ兴幹袕?fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行初步分析、鑒定[14-17]。因此，本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器技術(shù)(HPLC-DAD)對西藏產(chǎn)區(qū)的8批“亞特一號”良種金銀花花蕾和葉中的8種主要成分綠原酸、木犀草苷、隱綠原酸、異綠原酸、馬錢酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷、蘆丁進(jìn)行分析和含量測定，并與道地產(chǎn)區(qū)——山東產(chǎn)金銀花進(jìn)行對比。該研究為快速了解西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的化學(xué)成分含量和其后續(xù)臨床應(yīng)用提供了方法指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

ACCHROM 6000高效液相色譜儀(北京華譜科儀科技有限公司)；BSA萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)；SB-5200D型高功率數(shù)控超聲波儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需樣品均為西藏產(chǎn)區(qū)拉薩市采摘的“亞特一號”良種金銀花，其中包含8批金銀花花蕾和8批葉樣品，經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的花和葉。對照品綠原酸(批號：Y24J7K16726)、異綠原酸C(批號：MUST-14111414)、隱綠原酸(批號：MUST-15011413)、木犀草苷(批號：MUST-15012204)、蘆丁(批號：Y22S6S3719)、馬錢酸(批號：MUST-15012207)、馬錢苷(批號：R23D7F27552)、斷氧化馬錢苷(批號：Y21D7B30456)均購于上海源葉生物科技有限公司(純度均大于98%)。乙腈、乙酸為色譜純(美國Tedia公司)，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水(18 MΩ)，其他試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

將金銀花藥材粉碎，過4號篩。精密稱取金銀花藥材粉末0.2 g，甲醇溶液10 mL，40 ℃水浴加熱提取10 min，后加入純水5 mL，超聲(功率250 W，頻率20 kHz)30 min復(fù)提，用70%甲醇水溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，提取液過0.22 μm有機(jī)濾膜，即得供試品溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取馬錢酸(1)、綠原酸(2)、隱綠原酸(3)、馬錢苷(4)、斷氧化馬錢苷(5)、蘆丁(6)、木犀草苷(7)、異綠原酸C(8)對照品適量，加甲醇配制成濃度分別為1.0 mg/mL的對照品溶液，其中木犀草苷(70%甲醇)配制為0.5 mg/mL 的對照品溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

ACCHROM 6000高效液相色譜儀(北京華譜科儀科技有限公司)，Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水(0.2%甲酸)，梯度洗脫：0～10 min，8%～10% A；10%～20 min，10～15% A；20～30 min，15%～15% A；30～40 min，15%～25% A；40～50 min，25%～30% A，50～51 min，30%～100% A；51～60 min，100%～100% A；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。

2.4 HPLC方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

將木犀草苷、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸、馬錢酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷、蘆丁8種對照品溶液分別稀釋，得到不同濃度的對照品混合溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得到8種對照品的液相色譜圖，見圖1。以峰面積積分值(y)對質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行回歸計(jì)算，各化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限、定量限見表1。

表1 樣品回歸方程、檢出限和定量限Table1 Regression equations、detection limit and quantitative limit of samples

圖1 “亞特一號”金銀花蕾、葉提取物及8種對照品的HPLC色譜圖(254 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of extracts of flower buds and leaves of Lonicera japonica “AT1” and 8 kinds of control products(254 nm)

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液(批號為金銀花蕾1)連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測得其中8個(gè)特征峰的峰面積和保留時(shí)間，分別計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，其特征峰保留時(shí)間RSD依次為0.9%、0.9%、0.9%、0.7%、0.6%、0.9%、0.4%、0.2%，均小于1.0%，峰面積RSD依次為3.1%、0.6%、3.7%、3.6%、0.8%、2.7%、0.8%、2.0%，均小于5.0%，結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液(批號為金銀花蕾1)，按照2.3項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，8個(gè)特征峰保留時(shí)間RSD依次為1.1%、0.9%、0.9%、0.8%、0.6%、1.0%、1.5%、1.2%，峰面積RSD依次為4.8%、0.5%、4.8%、3.3%、0.8%、2.9%、1.8%、1.9%，均小于5%，表明樣品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)化學(xué)穩(wěn)定性良好，符合實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取供試品(批號為金銀花蕾1)6份，按2.1項(xiàng)下處理方法制成供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，測得8個(gè)特征峰的峰面積和保留時(shí)間，并計(jì)算其RSD。結(jié)果表明，8個(gè)特征峰保留時(shí)間RSD分別為1.0%、1.0%、1.0%、0.7%、0.6%、1.0%、0.5%、0.2%，峰面積RSD分別為4.7%、0.9%、4.1%、3.4%、0.8%、2.9%、0.7%、2.4%，均小于5.0%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好，符合實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求。

2.4.5 加標(biāo)回收率

精密稱取取供試品溶液(批號為金銀花蕾1)樣品6份，每份0.2 g，分別按照樣品中8種指標(biāo)成分含量80%、100%、120%共3個(gè)水平，加入對照品溶液，按2.1項(xiàng)下處理方法制成供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。馬錢酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸C的平均回收率分別為93.32%、94.15%、91.52%、91.01%、92.17%、104.33%、92.52%、95.67%；RSD分別為2.35%、3.20%、4.17%、3.02%、3.09%、3.98%、3.47%、2.36%。

2.4.6 含量測定

分別取8批亞特一號金銀花蕾和葉，采用2.1供試品溶液制備方法制備樣品溶液，采用2.3色譜條件分別進(jìn)樣分析，得出上述8種化合物的相應(yīng)峰面積，根據(jù)2.4.1方法中回歸方程算出各化合物的含量，平行3次取平均值，結(jié)果見表2。

表2 8批金銀花蕾和葉的含量測定結(jié)果(n=3)Table 2 Content determination results of 8 batches of flower buds and leaves of Lonicera japonica μg·g-1

續(xù)表2

馬錢酸綠原酸隱綠原酸馬錢苷斷氧化馬錢苷蘆丁木犀草苷異綠原酸C金銀花葉74 581.241 793.51 068.6719.22 750.82 164.99 106.3488.7金銀花葉83 599.432 182.3736.5605.22 130.51 887.76 913.7402.7金銀花葉平均值3 952.435 844.7833.4686.72 412.51 793.87 901.9456.7

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

超聲提取法具有快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，而水浴加熱提取法具有耗時(shí)短、提取率高等特點(diǎn)，本研究采用水浴加熱提取法結(jié)合超聲提取法來用于金銀花和金銀花葉中成分的提取，同時(shí)考察了提取溶劑、提取時(shí)間等因素對提取效率的影響。

考慮到金銀花中含有的化合物種類繁多，極性差別較大，故選擇先采用純甲醇作為提取溶劑水浴加熱，提取其中含有的極性較低的化合物；再加入純水，超聲提取其中高極性的化合物。綜合比較分析，通過增加水在提取溶劑中的比例，可以得到較多的色譜峰，故本實(shí)驗(yàn)選擇先采用10 mL純甲醇水浴加熱，再加入5 mL純水超聲提取。水浴提取時(shí)，采用10 min和20 min提取無明顯差別，故選擇水浴加熱10 min作為第一次提取時(shí)間；加入5 mL純水，分別超聲提取15 min、30 min和45 min，結(jié)果顯示30 min和45 min提取效率高于15 min，但采用30 min和45 min提取無明顯差別，故選擇時(shí)間較短的30 min作為第二次提取時(shí)間。

3.2 HPLC條件優(yōu)化

金銀花提取物中化學(xué)成分復(fù)雜多樣，化合物極性差別較大，故采用洗脫范圍較廣的乙腈-水作為流動(dòng)相對金銀花提取物進(jìn)行洗脫。另外，本實(shí)驗(yàn)考察比較了Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱以及SymmetryC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱共3個(gè)不同類型C18柱對金銀花提取物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱時(shí)分離度較好、色譜峰較多。因此，選用該柱對提取物進(jìn)行色譜分離分析。由于金銀花中有機(jī)酸類含量較高，色譜峰容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，故考慮通過在流動(dòng)相中加入少量的酸來改善分離度及峰型?？疾炝嗽谒嘀蟹謩e加入0.1%、0.2%、0.4%甲酸、0.2%和0.4%乙酸，對金銀花提取物色譜分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水相中加入0.2%甲酸時(shí)色譜峰對稱性較好、峰型較好，因此，選擇乙腈-0.2%甲酸作為流動(dòng)相。在波長選擇上，經(jīng)二極管陣列檢測器考察金銀花提取物中各類成分在190～400 nm波長下的紫外吸收效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在254 nm下金銀花中各成分均有吸收且有較好的分離度，因此，選擇254 nm作為金銀花提取物的檢測波長。同時(shí)考察得出柱溫25 ℃時(shí)，色譜峰分離度和峰型較好，因此選擇在此柱溫下進(jìn)行分析。

3.3 金銀花中活性成分含量的對比

從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，西藏產(chǎn)區(qū)金銀花花蕾中綠原酸的含量最高，平均含量為3.85%，斷氧化馬錢苷的含量最低；在金銀花葉中，綠原酸含量最高，平均含量為3.58%，異綠原酸C的含量最低。綜合金銀花蕾和葉的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷和異綠原酸C的含量分布中，金銀花蕾高于金銀花葉；而馬錢酸、斷氧化馬錢苷、蘆丁和木犀草苷4種成分含量在金銀花葉中分布高于金銀花蕾。

與金銀花道地產(chǎn)區(qū)山東所產(chǎn)的10批金銀花樣品進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的綠原酸平均含量(3.85%)遠(yuǎn)高于山東產(chǎn)區(qū)(1.62%)，而木犀草苷、異綠原酸C和馬錢酸的平均含量均略高于山東產(chǎn)區(qū)，蘆丁的平均含量則低于山東產(chǎn)區(qū)[18]，見圖2；與不同產(chǎn)地來源、品種的金銀花相比較，發(fā)現(xiàn)包含道地產(chǎn)區(qū)山東在內(nèi)的如河南、陜西、重慶、河北等13個(gè)金銀花樣品中綠原酸和木犀草苷的含量分別在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范圍內(nèi)[19-21]，而本研究中西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的綠原酸含量為3.36%～4.45%，木犀草苷含量為0.12%～0.17%，結(jié)果表明西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花中的綠原酸含量明顯高于一般品種的金銀花，木犀草苷含量也略高于多數(shù)品種的金銀花。

圖2 西藏金銀花和山東金銀花的活成分含量對比Fig.2 Comparison of active ingredient contentbetween Lonicera japonica in Tibet and that in Shandong

4 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器技術(shù)(HPLC-DAD)，對西藏產(chǎn)區(qū)的8批“亞特一號”良種金銀花花蕾和葉進(jìn)行了分析，并采用多指標(biāo)定量對其進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，得到的含量數(shù)據(jù)與其他產(chǎn)地、品種的金銀花進(jìn)行了對比。研究結(jié)果為西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的進(jìn)一步開發(fā)、利用提供方法和數(shù)據(jù)支持。