陳平 丁燕飛 忻笑容 謝玲 周郁芬 吳云林

脂質(zhì)運載蛋白-2(lipocalin 2，Lcn-2)，又稱中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白或噬鐵蛋白，是一種新型的分泌性蛋白，與炎癥、免疫反應(yīng)、細胞分化、細胞凋亡和組織重構(gòu)密切相關(guān)[1]。Lcn-2作為細胞化學趨化物N-甲酰硫亮氨酰苯丙氨酸的受體之一，可誘導白細胞內(nèi)顆粒釋放，趨化炎癥細胞聚集，消滅病原微生物。泌尿系感染、胃腸道炎癥、慢性阻塞性肺病、哮喘等疾病時Lcn-2呈高表達[2]，但其在急性胰腺炎(AP)時的表達狀況鮮見報道。本研究檢側(cè)急性壞死性胰腺炎(acute necrosis pancreatitis，ANP)大鼠Lcn-2的表達，分析Lcn-2表達與血淀粉酶、C反應(yīng)蛋白(c reactive protein, CRP)水平及繼發(fā)的急性肺損傷的關(guān)系，為AP發(fā)生、發(fā)展的預判及治療靶點提供依據(jù)。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：健康SD雄性大鼠，體重(150±30)g，由上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院動物實驗中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。術(shù)前禁食24 h、不禁水。按隨機表法將大鼠分為對照組(8只)和ANP組(24只)。采用胰膽管內(nèi)逆行注射3.5%?；悄懰徕c(1 ml/kg，Sigma公司)方法制備大鼠ANP模型。對照組注射等容積生理鹽水。ANP組分別在造模后6 、24、48 h分批處死，對照組于術(shù)后48 h處死。腹主動脈取血，離心分離血清，置-80℃保存。取胰腺、肺組織分別置4%多聚甲醛溶液固定和液氮中保存。

2．檢測指標：(1)血清CRP、淀粉酶水平，采用Beckman X7型全自動生化分析儀檢測；(2)胰腺、肺組織常規(guī)病理檢查，并參考文獻[3]的方法進行病理評分；(3)取支氣管肺泡灌洗液，應(yīng)用細胞計數(shù)板于光學顯微鏡下計數(shù)中性粒細胞和巨噬細胞總數(shù)；(4)取適量新鮮肺組織稱濕重，再置72℃干燥箱內(nèi)烘烤24 h后稱干重，計算肺濕/干重系數(shù)，即(濕重-干重)/干重×100%。

3．肺組織Lcn-2蛋白表達檢測：取固定的組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用S-P法行免疫組織化學染色檢測Lcn-2蛋白表達。兔抗鼠Lcn-2多克隆抗體購自Cell signaling公司，工作濃度1∶100。胞質(zhì)和(或)胞膜呈棕黃色為Lcn-2表達陽性。

取冷凍肺組織，應(yīng)用蛋白裂解液裂解獲取組織總蛋白，BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測Lcn-2蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參。兔抗鼠Lcn-2多克隆抗體工作濃度1∶100，辣根過氧化物酶標記二抗購自上?？党晒荆ぷ鳚舛?∶1 000。采用ECL液(Pierce公司)顯影。應(yīng)用Image J軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

二、結(jié)果

1．血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理改變：ANP組大鼠胰腺組織可見間質(zhì)腫脹，炎癥細胞浸潤，微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，紅細胞滲出，腺泡細胞和脂肪細胞壞死，且隨時間延長而加重。對照組大鼠胰腺組織未見明顯病理學改變。ANP組各時間點血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理學評分均較對照組顯著升高，且呈時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。

2．肺支氣管肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)、肺濕/干重系數(shù)及肺組織病理評分：ANP大鼠肺組織在造模后6 h可見肺泡間質(zhì)充血水腫，少量炎癥細胞浸潤；24 h可見肺泡間質(zhì)腫脹，肺泡壁破壞，炎癥細胞浸潤，微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)出血；48 h可見明顯的微血管壁結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)出血；對照組肺組織未見明顯病理學改變。ANP組肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)、肺濕/干重系數(shù)和肺組織病理學評分均較對照組顯著升高，并呈時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(表2)。

表1 大鼠血清CRP、淀粉酶水平及胰腺組織病理評分在對照組和ANP組的比較

注：與對照組比較，aP<0.01；與ANP 6 h組比較，bP<0.01；與ANP 24 h組比較，cP<0.01

表2 大鼠肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)、肺濕/干重系數(shù)及肺組織病理評分在對照組和ANP組的比較

注：與對照組比較，aP<0.01；與ANP 6 h組比較，bP<0.01；與ANP 24 h組比較，cP<0.01

3．肺組織Lcn-2蛋白表達：對照組肺泡細胞胞質(zhì)內(nèi)有少量棕色顆粒；ANP 6 h組胞質(zhì)內(nèi)有少量棕色顆粒，24、48 h組胞質(zhì)內(nèi)有密集的棕色顆粒(圖1)。對照組及ANP 6、24、48 h組肺組織Lcn-2表達量分別為0.13±0.03、0.22±0.03、0.32±0.03、0.42±0.03，ANP組較對照組顯著升高，且呈時間依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01，圖2)。

圖1 對照組(1A)及ANP 6、24、48 h組(1B、1C、1D)肺組織Lcn-2蛋白表達(免疫組化染色 ×400)

圖2 對照組(1)及ANP 6、24、48 h組(2、3、4)肺組織Lcn-2蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)

肺組織中的Lcn-2表達水平與肺組織損傷病理學評分、肺濕/干重系數(shù)和肺支氣管肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)均呈正相關(guān)(r值分別為0.862、0.866、0.875，P值均<0.01)。

討論AP繼發(fā)急性肺損傷的發(fā)生率可達35%，其機制可能與病程中胰酶自身消化和單核巨噬細胞活化激活中性粒細胞，釋放促炎遞質(zhì)，并通過炎癥遞質(zhì)級聯(lián)放大，誘導肺組織內(nèi)炎癥細胞積聚、活化，導致急性肺損傷，故急性肺損傷的實質(zhì)就是由多種炎癥細胞參與的肺臟組織過度炎癥反應(yīng)[4]。

Lcn-2屬載脂蛋白家族成員之一，在人體內(nèi)分布廣泛，如腎臟、支氣管、胃、小腸、胰腺、前列腺及胸腺等處[5]。有研究認為，Lcn-2參與鐵轉(zhuǎn)運、抗菌、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等過程；Lcn-2作為一種新型的細胞因子，參與細胞的生長分化調(diào)節(jié)及組織內(nèi)蛋白水解、膠原降解過程；Lcn-2具有調(diào)節(jié)胰島素敏感度的作用，在2型糖尿病的進展過程中扮演重要角色[6]。有研究認為，Lcn-2水平在炎癥反應(yīng)時表達上調(diào)，并與多種炎癥遞質(zhì)(IL-1、IL-2、IL-8和腫瘤壞死因子α)相互作用；Lcn-2參與運輸炎癥反應(yīng)的一些親脂因子(血小板活化因子、白三烯B4和脂多糖等)與MMP-9結(jié)合，促進MMP-9參與炎癥反應(yīng)，可作為評價炎癥導致的內(nèi)皮損傷嚴重程度指標之一[7-8]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺炎時呼吸道上皮細胞通過激活Toll樣受體4通路增加Lcn-2表達[9]，Lcn-2又促進呼吸道上皮細胞產(chǎn)生IL-8，參與介導中性粒細胞趨化活動，導致肺損傷[10]。AP并發(fā)腎損傷后18、24 h，尿中Lcn-2水平明顯升高，可作為急性腎損傷的早期標記物[11]，推測Lcn-2可能是一種類似于CRP的新型急性時相蛋白。 本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠血清CRP、淀粉酶水平及胰腺病理評分均增加，同時肺組織損傷呈時間依賴性加重，肺組織Lcn-2蛋白表達也呈時間依賴性上調(diào)，提示Lcn-2可作為監(jiān)測肺損傷嚴重程度的指標，為開展以Lcn-2為靶點的治療提供理論基礎(chǔ)。