伍朝榮 林威鵬 黃 飛 蔡一霞 田紀(jì)輝 呂 順 Joji Muramoto Carol Shennan 蔡昆爭?

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

（2 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007）

（3 廣東省東莞市香蕉蔬菜研究所，廣東東莞 523061）

（4 加州大學(xué)Santa Cruz分校環(huán)境系，CA 95064，USA）

青枯?。˙acterial wilt）是一種由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的毀滅性土傳病害。青枯菌作為一種好氧型細(xì)菌，最適生長溫度27～35℃，且不含內(nèi)生孢子和莢膜［1］。它存在明顯的菌系差異，根據(jù)對(duì)不同寄主植物的致病性反應(yīng)，可分為5個(gè)小種，有著廣泛的寄主，涉及54個(gè)科的450余種植物［2］，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最大的毀滅性土傳病害之一，威脅著熱帶和亞熱帶地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［3-4］。目前，青枯病的防治主要包括抗病育種、物理防治、生物防治、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)管理等，但效果仍不理想。

土壤消毒是一種高效快速殺滅土壤中真菌、細(xì)菌、雜草、土傳病毒、地下害蟲、嚙齒動(dòng)物的技術(shù)，是防治設(shè)施農(nóng)業(yè)土傳病蟲害最直接有效的方法之一，主要包括物理消毒、化學(xué)藥劑消毒和生物熏蒸消毒3大類。周雪青等［5］綜合比較了各種土壤消毒方法，認(rèn)為蒸汽熏蒸技術(shù)為最理想的土壤消毒方法，無污染，對(duì)任何害蟲均有效，但成本太高。目前，化學(xué)藥劑消毒是使用最廣泛、最方便且最有效的方法，但是過度使用會(huì)輸入大量殘留化學(xué)物質(zhì)，造成土壤及水體污染，危及農(nóng)產(chǎn)品安全，不符合綠色食品和有機(jī)食品生產(chǎn)要求。

21世紀(jì)初，荷蘭［6-7］和日本［8］科學(xué)家提出了一種生態(tài)替代化學(xué)熏蒸控制土傳病害的有效方法——土壤厭氧消毒（Anaerobic soil disinfestation,ASD），也稱為生物土壤滅菌（Biological soil disinfestations, BSD)或強(qiáng)還原土壤滅菌（Reductive soil disinfestation, RSD)。該方法被應(yīng)用于各種農(nóng)作物的土傳病害防控，如香蕉、草莓、番茄、蘆筍等［9-10］。顧志光［11］和黃新琦［12］等分別運(yùn)用添加有機(jī)物料并淹水來防治辣椒疫病和香蕉枯萎病等真菌性病害，伍朝榮等［13］添加有機(jī)物料并覆膜厭氧消毒防控細(xì)菌性病害番茄青枯病，均取得良好的防治效果。該方法的基本原理主要是通過向土壤添加易分解的有機(jī)碳源，然后灌水和覆膜形成厭氧環(huán)境，土壤微生物利用碳源產(chǎn)生大量對(duì)土傳病原菌有毒有害的分解產(chǎn)物，同時(shí)改變微生物群落結(jié)構(gòu)等從而有效防控病蟲害。多數(shù)研究表明，碳源類型及添加量、土壤類型、溫度及處理時(shí)長均能直接影響消毒效果［14-15］。Hewavitharana等［16］對(duì)比研究了雜草和乙醇作為添加物料對(duì)土傳病害的影響，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)腐霉屬和短體線蟲抑制效果無顯著差異，產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOC）的量也是同等數(shù)量級(jí)。Strauss和Kluepfe［17］認(rèn)為添加量為低于20.2 t hm–2即可形成病菌致命環(huán)境，而碳源可以選擇當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物剩余物。Wen等［18］研究發(fā)現(xiàn)，3 t hm–2秸稈添加量及田間持水量厭氧處理與1.5 t hm–2添加量及淹水厭氧處理對(duì)鐮刀菌抑制無顯著差異。此外，厭氧消毒處理時(shí)間越長，消毒效果越好［15］。目前，對(duì)該方法相關(guān)的作用機(jī)理尚未清楚，仍需要進(jìn)一步深入探討，從而為該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐參考。Shennan等［10］認(rèn)為今后應(yīng)該注重針對(duì)不同土傳病害防控，優(yōu)化方法，以及了解并揭示該方法防控病蟲害的機(jī)理機(jī)制。本研究的目的是探索不同碳源ASD對(duì)土傳病害青枯病防控、土壤改良及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，從而揭示其對(duì)青枯病的防控機(jī)理，為實(shí)踐應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

有機(jī)物料：選擇市場上容易獲得、使用廣泛和物料碳氮比差異較大的有機(jī)物料作為試驗(yàn)材料。盆栽試驗(yàn)選擇米糠、麥麩、茶麩、水稻秸稈，大田試驗(yàn)則為米糠、麥麩、花生麩，均由市場購買，粗粉狀，有機(jī)物料的碳氮含量及粒徑見表1。

表1 有機(jī)物料碳氮含量及碳氮比Table 1 Carbon and nitrogen content and C / N ratio of the organic materials tested

試驗(yàn)土壤：盆栽試驗(yàn)土壤來自廣州市增城區(qū) 朱村鎮(zhèn)朱村（東經(jīng)113.70°、北緯23.28°）的番茄種植基地，黏性土壤，其土壤特性如下：有機(jī)質(zhì)16.4 g kg-1，全氮0.81 g kg-1，全磷1.12 g kg-1，全鉀27.9 g kg-1，堿解氮82.65 mg kg-1，有效磷72.80 mg kg-1，速效鉀120.3 mg kg-1，pH4.55，電導(dǎo)率（EC）0.062 mS cm-1。大田試驗(yàn)在東莞市香蕉蔬菜研究所進(jìn)行，土壤特性如下：pH 5.50，有機(jī)質(zhì)18.32 g kg-1，堿解氮85.35 mg kg-1，有效磷118.3 mg kg-1，速效鉀229.17 mg kg-1。

試驗(yàn)番茄品種：盆栽試驗(yàn)選用易感青枯病的品種“臺(tái)灣紅圣女”。大田試驗(yàn)番茄栽培品種為“紅艷櫻桃番茄”，由廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院育成。

青枯菌菌種：選用青枯菌生理小種Ⅰ生化型Ⅲ，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。

1.2 盆栽試驗(yàn)

盆栽試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理：對(duì)照（CK）、厭氧處理（D）、米糠+厭氧處理（DRB）、麥麩+厭氧處理（DWB）、茶麩+厭氧處理（DTB）、水稻秸稈+厭氧處理（DRS），每個(gè)處理6次重復(fù)，有機(jī)物料添加量均為土重的2%（w/w）。每個(gè)處理分別稱取2.0 kg供試土壤，20.0 ml青枯菌菌懸液（青枯菌含量108CFU ml-1），相應(yīng)有機(jī)物料40.0 g，分別添加于盆缽中，充分混勻，澆水濕透，轉(zhuǎn)入20 cm×30 cm黑色自封袋中，密封厭氧處理3周。CK處理僅添加菌懸液，D處理不添加有機(jī)物料厭氧處理。所有處理于2016年5月8日至5月30日華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)農(nóng)場室外自然溫度進(jìn)行處理，期間日均溫度為26.64℃，處理結(jié)束取土壤樣品待測，并打開自封袋放置數(shù)天，排出揮發(fā)物。將厭氧處理后的土壤轉(zhuǎn)移至花盆中，每盤移栽2株番茄幼苗。

厭氧處理3周結(jié)束，取一份土壤樣品測定青枯菌數(shù)量，提取土壤全DNA進(jìn)行微生物高通量測序。另取一份土壤樣品測定氧化還原電位（Eh）、電導(dǎo)率（EC）和pH。番茄定植后，定期記錄發(fā)病率，試驗(yàn)結(jié)束后測定番茄植株株高、莖粗、鮮重。

1.3 大田試驗(yàn)

于2016年7月至12月在東莞市香蕉蔬菜研究所內(nèi)（東經(jīng)113.41°；北緯23.00°）進(jìn)行田間試驗(yàn)，供試土壤為番茄青枯病連作障礙土，上茬番茄青枯病發(fā)病率達(dá)85%以上。試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照（CK）、米糠+厭氧（DRB）、麥麩+厭氧（DWB）和花生麩+厭氧（DPB）4個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)（10 m×1.2 m）。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3種有機(jī)物用量均按1 kg m-2添加至指定小區(qū)，旋耕機(jī)充分混勻，鋪設(shè)滴管并蓋膜密閉，灌溉至完全濕透，厭氧處理3周。處理結(jié)束，去膜，放置數(shù)天，每個(gè)小區(qū)定植20株番茄幼苗，行距40 cm，株距50 cm。所有處理按照常規(guī)進(jìn)行田間施肥管理，番茄生長前期按照750 kg hm-2施用一次復(fù)合肥。在番茄移栽后2、4、6、8周調(diào)查番茄青枯病的發(fā)病率，成熟期測定番茄株高和產(chǎn)量。

1.4 指標(biāo)測定方法

土壤青枯菌數(shù)量：選用2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑培養(yǎng)基［19］，采用平板計(jì)數(shù)法測定土壤中青枯菌數(shù)量。

土壤溫度：厭氧處理期間，采用紅外測溫儀于一天中土溫最高時(shí)段約15:00對(duì)土壤表層進(jìn)行測定，每隔3 d測定一次，共測定5次，取平均值。土壤pH：以1.0 mol L-1KCl作為溶劑土液比1︰5，用雷磁PHS-3C型酸度計(jì)測定。土壤電導(dǎo)率（EC）：以水土比5︰1提取，SIN CT-TDS3031型電導(dǎo)率儀測定C。土壤氧化還原電位（ORP）：采用SX712型ORP計(jì)測定。

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析：稱取0.5 g盆栽試驗(yàn)厭氧消毒處理的土樣（6個(gè)處理，4個(gè)重復(fù)，共24個(gè)土壤樣品），使用試劑盒(MP Biomedical, Santa Ana, USA)提取土壤DNA，用瓊脂糖電泳檢驗(yàn)提取DNA質(zhì)量，用微量分光度計(jì)Nanodrop1000（Thermo Scientific，USA)測定DNA濃度與純度，并將其稀釋至10 ng μl－1放置于－80℃冰箱中待用。采用帶有barcoded 的特異引物341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)，擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)域的片段。PCR體系及程序按照 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(New England Bio labs)說明進(jìn)行。使用瓊脂糖電泳對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定與分離。使用 Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany) 對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收用于后續(xù)建庫，產(chǎn)物進(jìn)行回收用于后續(xù)建庫，Miseq2500 PE250平臺(tái)進(jìn)行測序。

使用Mothurv 1.32［20］對(duì)測序序列進(jìn)行組裝，對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及序列拼接，從24樣品總共得到優(yōu)化序列853597條，優(yōu)化序列按照97%的相似性，進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚合后，在Green Gene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)與注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)與注釋［21］。

基于O T U s對(duì)細(xì)菌α-多樣性指數(shù)A c e，Chao1，辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)進(jìn)行估算［22-23］?；跇悠烽gOTUs的Unifrac距離，進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis, PCA)［24］，為了降低數(shù)據(jù)噪聲，我們使用物種至少在一個(gè)樣本中包含tags數(shù)量達(dá)到總tags數(shù)量的0.1%作為閾值，對(duì)滿足該條件的物種進(jìn)行PCA分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

不同處理間差異的顯著性采用單因素方差分析與LSD法多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)（one-way ANOVA，p＜0.05），以上統(tǒng)計(jì)分析通過SPSS 18.0實(shí)現(xiàn)，圖和表分別采用Origin 8.0和Office 2010制作。

2 結(jié) 果

2.1 土壤厭氧消毒對(duì)青枯菌的抑制及番茄生長的影響

由圖1可知，除了米糠+厭氧處理（DRB）外，土壤厭氧消毒能有效防控青枯病的發(fā)生并促進(jìn)植株生長。與對(duì)照相比，添加有機(jī)物料厭氧處理青枯病發(fā)病率為0，僅厭氧處理（D）為16.7%。表明土壤厭氧消毒對(duì)青枯病防效達(dá)100%。除了添加米糠厭氧消毒對(duì)番茄生長無顯著影響外，其余厭氧處理均顯著提高植株鮮重、株高和莖粗。

2.2 土壤厭氧消毒對(duì)土壤理化性狀的影響

圖1 土壤厭氧消毒對(duì)盆栽植株發(fā)病率及生長的影響Fig. 1 Effect of anaerobic disinfestation of the soil on disease incidence and growth of plants (Pot experiment)

由圖2可以看出，所有厭氧處理均顯著提高了土壤溫度，平均提高6～8℃。與CK相比，單純的厭氧處理（D）對(duì)土壤pH沒有顯著影響，而不同碳源的ASD處理顯著提高土壤pH，提高幅度為8%～13%。厭氧處理均顯著降低了土壤Eh，且添加有機(jī)物料厭氧處理Eh均為負(fù)值，使土壤呈強(qiáng)還原性狀態(tài)。各處理對(duì)EC的影響不一致，與CK相比，添加米糠（DRB）和不添加物料（D）處理EC值無顯著變化，而添加麥麩（DWB）、茶麩（DTB）和秸稈（DRS）處理EC值顯著提高了10倍以上。

圖2 土壤厭氧消毒對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of anaerobic disinfestation on soil physical and chemical properties

2.3 土壤厭氧消毒對(duì)土壤青枯菌數(shù)量的影響

由圖3可知，與對(duì)照相比，添加有機(jī)物料的厭氧消毒顯著降低了土壤中可培養(yǎng)青枯菌數(shù)量，降低幅度為81.0%～96.5%，且降低幅度呈數(shù)量級(jí)，而單純的厭氧處理（D）土壤中可培養(yǎng)青枯菌含量與對(duì)照無顯著差異。

2.4 土壤厭氧消毒對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的影響

土壤厭氧消毒能顯著影響土壤細(xì)菌群落多樣性。由表2可得，α多樣性指數(shù)Ace、Chao1、辛普森和香農(nóng)對(duì)不同處理的響應(yīng)及趨勢基本一致，即CK、D和DRB處理均顯著高于DWB、DTB和DRS。與對(duì)照相比，添加有機(jī)物料厭氧處理降低了土壤細(xì)0.05 level菌的多樣性，降低幅度因添加物料種類而異。

圖3 土壤厭氧消毒對(duì)土壤青枯菌數(shù)量的影響Fig. 3 Effect of anaerobic disinfestation on population of Ralstonia solanacearum in the soil

表2 土壤厭氧消毒對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的影響Table 2 Effects of anaerobic disinfestation on soil bacterial diversity index

在門水平下對(duì)樣品間細(xì)菌群落進(jìn)行主成分分析，以觀察不同處理下對(duì)微生物影響的相關(guān)聯(lián)性，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)過PCA降維后，所提取的PC1對(duì)總方差的解釋率為48.7%，PC2的解釋率為15.2%，兩者總占比為63.7%。從PC1看，6個(gè)處理明顯分為兩類，第一類在PC1的值為正值，包含DWB（麥麩）、DTB（茶麩）、DRS（秸稈）。第二類在PC1的值為負(fù)值，包含CK、D、DRB等。而且有一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，6種處理出現(xiàn)兩兩以Y軸對(duì)稱分布的現(xiàn)象，CK與DWB對(duì)稱，D與DTB對(duì)稱，DRB與DRS對(duì)稱。

圖4 門水平上的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis on the phylum level

對(duì)不同處理細(xì)菌主要門類進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5。不同處理豐度前10的細(xì)菌門類均為泉古菌門（Crenarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、酸桿菌門（A c i d o b a c t e r i a）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和變形菌門（Proteobacteria），表明厭氧消毒并無改變土壤主要微生物的門類，但能顯著改變優(yōu)勢種群的比例。與CK相比，全部厭氧處理的泉古菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門及變形菌門細(xì)菌相對(duì)豐度均有所下降，而添加有機(jī)物料厭氧處理組厚壁菌門相對(duì)豐度顯著增加，其中DWB、DTB和DRS增加最為顯著。放線菌門相對(duì)豐度在各處理間變化不一，D和 DRB處理較CK顯著增加，而DWB、DTB和DRS則顯著降低。

厚壁菌門微生物進(jìn)一步分析表明，厚壁菌門中梭菌科、瘤胃菌科和芽孢桿菌科3個(gè)科的細(xì)菌變化幅度最大。與對(duì)照相比，D、DRB處理組的梭菌科（大部分為厭氧菌）相對(duì)豐度無顯著差異，而DWB、DTB和DRS顯著提高，其中DWB處理數(shù)值最高且顯著高于其他處理組（圖6）。除DTB處理的瘤胃菌科和芽孢桿菌科的相對(duì)豐度顯著高于CK，其他處理組無顯著差異，但總體上表現(xiàn)為DWB、DTB、DRS處理組的相對(duì)豐度高于CK、D、DRB。

2.5 土壤厭氧消毒的田間示范效應(yīng)

由圖7可以看出，番茄定植第2周開始發(fā)病，CK組發(fā)病率始終高于其他厭氧處理組，DRB、D W B、D P B處理番茄發(fā)病率較C K分別降低71.2%、55.9%、50.6%。與CK相比，各厭氧處理均顯著提高了番茄產(chǎn)量，增幅達(dá)2.5倍～4.7倍，其中麥麩+厭氧處理（DWB）產(chǎn)量增幅最大，米糠+厭氧處理（DRB）最小。此外，DWB和DPB能顯著提高番茄株高和莖粗，而DRB則無顯著影響。值得注意的是，DRB處理組對(duì)青枯病防控效果最好，但番茄株高和莖粗均小于CK，植株矮小。

圖5 土壤厭氧消毒對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響Fig. 5 Effect of anaerobic disinfestation on the bacterial community structure in the soil

圖6 梭菌科、瘤胃菌科和芽孢桿菌科相對(duì)豐度變化Fig. 6 Relative abundance of Clostridiaceae, Ruminococcaceae and Bacillaceae

3 討 論

3.1 土壤厭氧消毒對(duì)青枯病的防控作用

圖7 土壤厭氧消毒對(duì)大田植株發(fā)病率及生長的影響Fig. 7 Effect of anaerobic soil disinfestation on disease incidence and plant growth (Field experiment)

以往研究表明［25］，ASD處理能夠有效抑制50%～94%的病原細(xì)菌、卵菌（oomycete）和真菌，對(duì)線蟲抑制率達(dá)15%～56%，對(duì)雜草抑制率達(dá)32%～81%，并能顯著提高作物的產(chǎn)量。van Overbeek等［26］運(yùn)用ASD長時(shí)間處理青枯菌病土，能使土壤中青枯菌數(shù)量降低99.4%以上。伍朝榮等［13］研究發(fā)現(xiàn)，ASD對(duì)番茄青枯病的防控效果達(dá)90%以上，且顯著促進(jìn)了番茄生長。本研究中，盆栽和大田試驗(yàn)結(jié)果均表明，不同有機(jī)物料（米糠、麥麩、茶麩、秸稈）ASD處理對(duì)番茄青枯病具有較好的防控效果，且能促進(jìn)作物的生長（除DRB外），提高番茄產(chǎn)量。不同碳源添加對(duì)青枯菌的抑菌效果與碳源C/N有關(guān)（圖3），DWB（C/N=43.7）和DTB（C/N=49.6）殺菌效果優(yōu)于DRS（C/N=72.7）和DRB（C/N=81.9），這與Liu等［27］報(bào)道的有機(jī)物料C/N與RSD殺菌效果之間存在負(fù)相關(guān)的結(jié)論一致，也是本試驗(yàn)選擇不同C/N有機(jī)物料的原因。盆栽和田間試驗(yàn)發(fā)病率ASD處理均顯著低于對(duì)照，但田間試驗(yàn)仍呈高狀態(tài)，原因可能包括:（1）大田作為一個(gè)開放狀態(tài)，ASD處理過程中難以形成與盆栽相對(duì)密封厭氧狀態(tài)；（2）灌溉方式、農(nóng)用機(jī)械工具、人工修剪等病原菌傳播，從而影響了實(shí)際處理效果。

3.2 土壤厭氧消毒對(duì)土壤特性的影響

ASD通過添加有機(jī)物料和厭氧發(fā)酵，能在短時(shí)間內(nèi)顯著改變土壤理化性質(zhì)，主要包括pH，Eh和EC等的變化。土壤pH變化與添加物料種類和土壤類型有關(guān)，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)ASD能產(chǎn)生有機(jī)酸，使pH小幅度降低［28-29］。本研究土壤pH升高可能與試驗(yàn)用土pH（4.55）較低有關(guān)。ASD處理使Eh則由正值快速降低至負(fù)值，并持續(xù)整個(gè)厭氧處理過程，該指標(biāo)能間接顯示土壤已形成厭氧環(huán)境［30］。而青枯病原菌是一種好氧型細(xì)菌，厭氧條件下，其生長生理等方面可能受到極大的抑制。ASD處理下EC總體上也是呈增長態(tài)勢，主要是ASD處理過程釋出部分正負(fù)離子［31］。本試驗(yàn)Eh顯著降低和EC的提高均與前人研究結(jié)果類似。

3.3 土壤厭氧消毒對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

ASD能在短時(shí)間內(nèi)形成厭氧、強(qiáng)還原性、高溫等環(huán)境，并能產(chǎn)生揮發(fā)性氣體、有機(jī)酸、低價(jià)重金屬等各類有毒物質(zhì)，這導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化可能是土壤厭氧消毒防控土傳病害的機(jī)理之一［17］。如病原菌數(shù)量減少或致病力降低可以達(dá)到防控病害的效果。研究表明，ASD處理能誘導(dǎo)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，增加土壤中的拮抗菌數(shù)量從而降低病原菌的危害［6,32-34］。

本研究的土壤微生物高通量測序結(jié)果顯示，添加不同有機(jī)物料（DRB、DWB、DTB和DRS）土壤厭氧消毒中厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度大幅提高，其中DWB、DTB和DRS處理的厚壁菌門的相對(duì)豐度占主導(dǎo)。該門下的梭菌科和瘤胃菌科（大部分為厭氧菌）、芽孢桿菌科（耐性強(qiáng)）的相對(duì)豐度也大幅提升，這與Mowlick［33］結(jié)果相似，這些細(xì)菌種類可能對(duì)青枯菌產(chǎn)生拮抗作用，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。比如Ueki等［35］從土壤厭氧消毒處理中分離到梭菌屬（Clostridium）的兩株厭氧型菌株（H110和TB8）能破壞鐮刀菌細(xì)胞壁，達(dá)到致死該病原菌的作用。Strauss等［36］研究結(jié)果顯示ASD能改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，影響致死病原農(nóng)桿菌和腐霉菌。不同有機(jī)碳源的ASD 處理微生物群落結(jié)構(gòu)變化存在一定差異，優(yōu)勢群落相對(duì)豐度的增加總體趨勢一致。因此，土壤厭氧消毒通過提高厚壁菌門細(xì)菌群落豐度，促進(jìn)厭氧型和耐受型等細(xì)菌生長，從而抑制包括病原菌等其他細(xì)菌群落生長，達(dá)到控制病害的效果。

Tomihama等［37］研究表明農(nóng)田添加米糠能有效提高土壤中放線菌相對(duì)豐度，放線菌含大部分拮抗菌，從而對(duì)馬鈴薯瘡痂病的防控有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)添加米糠的厭氧消毒（DRB）番茄株高、莖粗和鮮重等指標(biāo)均低于CK，但防控青枯病效果較佳，這可能與該處理放線菌相對(duì)豐度顯著高于CK有關(guān)。本研究還初步發(fā)現(xiàn)，不同有機(jī)物料添加產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體均能有效抑制青枯菌的生長。雖然不同有機(jī)物料厭氧消毒產(chǎn)生的殺菌物質(zhì)不盡相同［16］，但也有相同物質(zhì)產(chǎn)生，有研究發(fā)現(xiàn)ASD處理產(chǎn)生的氨氣、乙酸和丁酸能大幅度抑制土壤茄勞爾氏菌的數(shù)量［28，38］。此外，本實(shí)驗(yàn)及相關(guān)研究表明ASD處理土壤氧化還原電位變?yōu)樨?fù)值、溫度升高、pH升高等引起的厭氧環(huán)境的變化，可能不利于青枯菌生長?？傊?，ASD防控番茄青枯病的機(jī)理包括多個(gè)方面，而改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，可能是重要機(jī)理之一。

4 結(jié) 論

盆栽條件下，通過添加不同碳源ASD處理均能提高土壤pH、土溫，形成還原性（厭氧）環(huán)境，土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)降低，部分厭氧型、耐性強(qiáng)的細(xì)菌相對(duì)豐度也大幅提升，成為優(yōu)勢種群。這有效抑制了土壤中青枯病原菌數(shù)量及其對(duì)番茄的侵染，大大降低青枯病發(fā)病率。ASD田間示范，同樣表現(xiàn)出能顯著降低番茄青枯病的發(fā)生，促進(jìn)植株健康生長，大幅提高番茄產(chǎn)量。研究表明，該方法對(duì)防控青枯病具有較好效果，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。