于建忠

腦卒中是一種嚴(yán)重危害國(guó)內(nèi)外中老年人的常見(jiàn)病，它具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，既往發(fā)病機(jī)制的研究表明，腦卒中與遺傳因素密切相關(guān)，而動(dòng)脈粥樣硬化又是腦卒中最常見(jiàn)的原因之一。TNFα誘導(dǎo)蛋白3相互作用蛋白1（TNFα -induced protein 3-interacting protein 1，TNIP1），又稱為A20結(jié)合核因子κB抑制蛋白1（ABIN1），可與多種受體結(jié)合，如腫瘤壞死因子（TNFα）、上皮生長(zhǎng)因子（EGFR）、TOLL樣受體、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）等，是一種炎癥調(diào)節(jié)因子，而炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中，這種炎癥反應(yīng)尤其明顯，并且可能導(dǎo)致該類患者的心血管疾病死亡率增高[1-2]，因此，TNIP1可能通過(guò)參與炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本研究擬探討TNIP1基因rs7708392多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 包括腦卒中高危人群和健康體檢人群，依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部《2013年腦卒中高危人群篩查和干預(yù)項(xiàng)目技術(shù)方案》的參考標(biāo)準(zhǔn)，自2014年5月—2017年8月，以海南省內(nèi)的鄉(xiāng)鎮(zhèn)社區(qū)常住人口作為腦卒中高危人群的篩查對(duì)象，選定海南省文昌市及?？谑械脛偕成鐓^(qū)作為篩查地區(qū)，所有入組人群均為漢族人，年齡≥40歲常住人口作為篩查對(duì)象，根據(jù)腦卒中高危人群篩查和干預(yù)工作流程，依據(jù)以下危險(xiǎn)因素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：（1）高血壓病史（≥140/90mmHg）或正在服用降壓藥；（2）房顫或明顯的脈搏不齊；（3）吸煙；（4）血脂異?；蛭粗唬?）糖尿?。唬?）日常很少的體育運(yùn)動(dòng)（體育鍛煉的參照準(zhǔn)則是每周鍛煉大于3次、每次大于30分鐘、持續(xù)時(shí)間不少于1年；從事中重度體力勞動(dòng)者視為經(jīng)常有體育鍛煉）；（7）明顯超重或肥胖（BMI≥26kg/㎡）。凡符合以上任意3條，則判定為腦卒中的高危人群。

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意自2014年9月—2017年8月期間，在湘雅附屬海口醫(yī)院體檢中心內(nèi)科診室收集健康人群的樣本，采集參與者周圍靜脈血，同時(shí)，詢問(wèn)病史，收集相關(guān)的指標(biāo)，包括年齡、性別、血壓、吸煙飲酒情況、家族史等。

入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組者必須為本地籍貫且長(zhǎng)期居住漢族人，相互之間無(wú)血緣關(guān)系；（2）自愿入組者經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)咨詢同意后簽訂知情同意書(shū)，并符合入組及排除標(biāo)準(zhǔn)的體健者判定為健康組研究人群；（3）所有入組者必須具備頸部血管B超檢查。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）外地籍貫及本省籍貫但不在此居住者；（2）既往無(wú)心腦血管病病史；（3）無(wú)嚴(yán)重的心肝腎疾病史；（4）無(wú)全身免疫系統(tǒng)疾病，如系統(tǒng)性血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織病史；（5）無(wú)心臟病史，如冠心病、心力衰竭等；（6）無(wú)癌癥病史。

根據(jù)頸部血管彩超檢查有無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化分為病例組和對(duì)照組。檢查提示具有內(nèi)膜增厚、血管斑塊或血管狹窄者歸入病例組；頸部動(dòng)脈血管無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn)為對(duì)照組。

對(duì)所有符合條件的入組者，在入組的當(dāng)天或次日清晨空腹?fàn)顩r下，采集3～5ml周圍靜脈血，放置在EDTA抗凝試管中，置于-20℃冰箱中暫時(shí)儲(chǔ)存，分批次集中提取樣本DNA，以備后期進(jìn)一步研究。

1.2 主要試劑和儀器 GoldMag-Mini全向基因DNA純化試劑盒（117883）和Sequenom公司iPLEX Gold試驗(yàn)技術(shù)，試劑包括：進(jìn)口純凈水、PCR Buffer（10×）、MgCl2（25mM）、iPLEX Buffer（10×）、dNTP mix（25mM）、iPLEX 酶、Hotstar Taq（5U/μL）、Termination mix、SAP 酶 （1.7U/μL）、SAP Buffer（10×）、SpectroCLEAN 樹(shù) 脂 。GeneAmpPCR System9700 PCR儀、NanoDrop2000分光光度儀、MassARRAY質(zhì)譜儀。

1.3 方 法

圖1 rs7708392位點(diǎn)的基因分型圖

1.3.1 DNA提取 使用西安金磁納米生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的GoldMag-Mini全血基因組DNA純化試劑盒（批號(hào)117885）進(jìn)行樣本DNA的提取純化，嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作提取全血DNA。并對(duì)所得到的DNA采用NanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度。只有DNA濃度和純度都在允許范圍內(nèi)的樣品，才可作為合格樣品用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)主要是使用Sequennom MassARRAY Assay Design 3.0 software軟件，通過(guò)該軟件對(duì)所選位點(diǎn)進(jìn)行引物及單堿基延伸引物的設(shè)計(jì)。rs7708392的引物位點(diǎn)如下：1st-PCR引物：ACGTTGGATGAGGCCAACTGGTCAATTCTC；2nd-PCR引物：ACGTTGGATGGGGTCTCTTCTGGAACTT AG；UEP 序列：ggggaTGGAACTTAGTAGACTAGTCA

1.3.3 基因分型 本實(shí)驗(yàn)采用Sequennom MassARRAY分子量陣列技術(shù)對(duì)所選擇的位點(diǎn)進(jìn)行分型，即將 MassARRAY iPLEx（sequelloin，SanDiego，CA）的分型平臺(tái)與時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)（MassARRAY sequenom SNP）相結(jié)合的方法。分型步驟：PCR擴(kuò)增反應(yīng)以延伸基因位點(diǎn)兩端的序列；SAP酶處理以降解擴(kuò)增用的dNTP；延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)；樹(shù)脂除鹽純化；上機(jī)點(diǎn)樣；MassARRAY Analyzer Compact質(zhì)譜檢測(cè)，根據(jù)質(zhì)譜峰的位置確定分子質(zhì)量，進(jìn)行基因分型（圖1）。基因位點(diǎn)分型依據(jù)：第一條紅色虛線為UEP的分子量，第二條紅/藍(lán)色虛線為UEP+G堿基的分子量，第三條紅/藍(lán)色虛線為UEP+C的分子量。若第三條線處出峰，則為CC型純合子。若第二條線處出峰，則為GG型純合子。兩條線處均出峰，則為GC雜合子。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SNPStats在線軟件（https://www.snpstats.net）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。（1）研究對(duì)象的一般資料分析：計(jì)量資料采用T檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；（2）哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)：計(jì)算對(duì)照組中基因位點(diǎn)的基因型及等位基因頻數(shù)，并認(rèn)為對(duì)照組中最小的等位基因頻率作為風(fēng)險(xiǎn)等位基因。然后，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照組內(nèi)基因位點(diǎn)的平衡性進(jìn)行檢驗(yàn)，若P＞0.05，則說(shuō)明滿足哈迪-溫伯格平衡，相反，若P＜0.05，則表明所選取的樣本未達(dá)到隨機(jī)平衡狀態(tài)，不具有群體代表性。（3）疾病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析：測(cè)定基因型與疾病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系[4]。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較 本研究共納入病例組264例，其中男性 110例，女性 154例，年齡（65.15±10.87）歲，對(duì)照組320例，其中男性148例，女性172例，年齡（65.69±10.77）歲，兩組之間在年齡、性別、吸煙史、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCHO）、低密度脂蛋白（LDL）的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病例組高密度脂蛋白（HDL）高于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表 1。

2.2 哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn) 該位點(diǎn)在兩組中的基因型頻率符合哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)（P＞0.05）。兩組人群最小等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 基因模型比較 在矯正年齡、性別的情況下，計(jì)算各個(gè)模型下的優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%的可信區(qū)間（95%CI）。兩組間所有基因模型下差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

在男性亞組中，rs7708392在顯性模型、加性模型及雜合子情況下增加動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05）；而在女性亞組中，該變異在任何模型下差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 3、4。

3 討論

目前，TNIP1基因變異與腦血管病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，TNIP1基因rs7708392位點(diǎn)可能增加動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5]。那么，rs7708392與動(dòng)脈的粥樣硬化之間是否具有相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)在整體分析中該變異在等位基因以及五種遺傳模型下與動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在亞組分析時(shí)，男性亞組人群中，該位點(diǎn)在顯性、加性及雜合子模型下增高動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（P＜0.05）。

表1 病例組與對(duì)照組臨床資料比較（%±s）

表1 病例組與對(duì)照組臨床資料比較（%±s）

注：TG：甘油三酯；TCHO：膽固醇；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白

組別對(duì)照組病例組P值例數(shù)320 264年齡（歲）65.69±10.77 65.15±10.87 0.55性別（女）[例（%）]172（53.75）154（58.33）0.27吸煙[例（%）]45（14.06）29（10.98）0.27 TG（mmol/L）2.13±1.34 2.01±1.21 0.26 TCHO（mmol/L）5.69±1.04 5.73±1.14 0.71 HDL（mg/dL）1.36±0.36 1.54±0.50＜0.01 LDL（mg/dL）3.68±0.90 3.74±0.88 0.37

表2 rs7708392多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性

表3 男性亞組rs7708392多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性

表4 女性亞組rs7708392多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

TNIP1基因位于人染色體5q32～q33.1，其中外顯子18個(gè)，該基因所編碼的A20結(jié)合核因子κB抑制蛋白1（ABIN1），ABIN1與其配體A20蛋白結(jié)合并相互作用，可以下調(diào)NF-κB病理通路的活性[6]。TNIP1基因過(guò)表達(dá)還可以通過(guò)抑制腫瘤壞死因子α（TNFα）而抑制 NF-κB 的活性[7]。TNIP1 基因多態(tài)性可能通過(guò)影響基因表達(dá)或功能引起NF-κB病理通路異常，從而誘導(dǎo)炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生。亦有動(dòng)物模型研究[8]發(fā)現(xiàn)小鼠模型血管內(nèi)皮功能失衡和心肌的肥厚，ABIN1參與慢性炎癥與心血管疾病的發(fā)生。所以，TNIP1在炎癥、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、心腦血管病的發(fā)生等方面起著重要作用。

目前，關(guān)于TNIP1基因變異的研究，主要集中在自身免疫性疾病如銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的人群中，并且該基因的突變可增加系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患病風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。rs7708392研究也以系統(tǒng)性紅斑狼瘡為主，雖然該變異位點(diǎn)存在遺傳異質(zhì)性，有種族或地域的差異性，歐洲人群G等位基因頻率（約70%）顯著高于亞洲人群（約30%），但是，多項(xiàng)研究[11-13]證實(shí)該位點(diǎn)確實(shí)增加中國(guó)漢族、歐洲及日本人群紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)納入12篇研究的Meta分析[14]提示該位點(diǎn)增高紅斑狼瘡的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但是，他們的研究結(jié)論顯示C等位基因頻率增高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究顯示，雖然該變異在總體分析時(shí)兩組間未見(jiàn)顯著性差異，但在男性亞組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)GC基因型、加性模型和顯性模型都可能與動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。由此可見(jiàn)，該基因變異在紅斑狼瘡和動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死中發(fā)揮著重要作用，但是，具體的致病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究存在一些不足：（1）本次研究中，動(dòng)脈粥樣硬化的界定主要依據(jù)頸部血管彩超檢查，部分病例可能有其他部位的動(dòng)脈粥樣硬化，從而造成分組的錯(cuò)誤；（2）由于樣本量有限，尤其是在亞組分析時(shí)，因此有待進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；（3）由于僅僅對(duì)單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究，基因-基因交互作用研究仍有待進(jìn)一步開(kāi)展。（所有數(shù)據(jù)由本人在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院讀博期間于附屬?？卺t(yī)院采集完成。）