洪偉鵬 趙永華 曹霖 曹迪 趙鐘祥 金晶

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，而非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占其中的80%-85%[1]。含鉑方案是NSCLC晚期化療的標準方案，然而其治療效果經(jīng)常達不到令人滿意的程度，其中最主要的原因是順鉑的耐藥性[2]。因此，深入了解NSCLC順鉑耐藥的機制，并根據(jù)此獲得有效的治療方法，已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點之一。

代謝組學是系統(tǒng)生物學新興起的一個分支，它可以通過考察生物體的代謝產(chǎn)物及其動態(tài)變化來研究其代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，對其發(fā)生發(fā)展過程的代謝物進行定性和定量分析可以識別未知的代謝產(chǎn)物[3]。目前腫瘤標志物的代謝組學研究主要通過對患者的血液、尿液或者癌組織進行分析，但由于年齡、性別、飲食、環(huán)境等因素所造成的個體差異較大，對腫瘤及腫瘤耐藥標志物的識別產(chǎn)生了極大的影響。因此以腫瘤細胞作為代謝組學研究對象，通過細胞代謝物的差異表達尋找潛在的特異性標志物，可以有效地避免個體差異與復雜性問題，已經(jīng)成為一種常見的研究方法[4]。

本研究以NSCLC與其順鉑獲得性耐藥細胞為基礎(chǔ)，基于超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法（ultraperformance liquid chromatography coupled with time of flight mass spectrometry,UPLC-TOF-MS），并結(jié)合代謝組學數(shù)據(jù)處理方法，對兩種細胞的代謝提取物進行處理及分析，為考察NSCLC順鉑耐藥細胞與敏感性細胞的內(nèi)源性小分子代謝差異，尋找與其耐藥性相關(guān)的代謝組學特征，探究潛在的標志物，為順鉑耐藥性的確證和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Triple-TOFTM5600+型三重四級桿飛行時間質(zhì)譜（美國AB SCIEX公司）。超高效液相系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）：LC-30AD高效液相色譜儀、SIL-30AC自動進樣器、SPD-M20A檢測器、CTO-20AC柱溫箱。25 cm2細胞培養(yǎng)皿（美國Corning公司）。胎牛血清（美國Gibco公司）、DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）高糖培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；甲醇、乙腈（HPLC級，美國TEDIA公司）。

1.2 細胞來源 人NSCLC細胞A549和順鉑獲得性耐藥細胞A549/DDP購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 細胞培養(yǎng) A549、A549/DDP細胞在37 ℃、5%CO2的條件下，貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。細胞均培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)皿中，每種細胞平行培養(yǎng)6份，長滿之后用于提取代謝組分并檢測。

1.4 細胞提取方法 取對數(shù)生長期的細胞，用1 mL冰磷酸緩沖液（PBS）清洗2遍，加入1.5 mL冰甲醇后，靜置3 min，刮下細胞，吸出細胞碎片溶于15 mL離心管中，加入3 mL二氯甲烷、1.5 mL甲醇和2.7 mL滅菌水，渦旋5 min，4 ℃下6,000 rpm離心10 min，分別吸取上層極性層和下層非極性層于干燥離心管中，真空干燥揮干，置于-20 ℃冰箱中保存直至進樣分析。

1.5 液相條件

1.5.1 酸性條件 流動相A：0.1%甲酸-色譜乙腈；流動相B：0.1%甲酸-水；色譜柱：Waters Acquity UPLCBEH Amide（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）；柱溫：45 °C；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；洗脫梯度為：0 min，1%；0.1 min，1%；7 min，70%；7.5 min，1%；10 min，1%；10.01 min，停止。

1.5.2 堿性條件 流動相A：95%乙腈-水（10 mmol/L乙酸銨，pH 9）；流動相B：5%乙腈-水（10 mmol/L乙酸銨，pH 9）；色譜?。篧aters Acquity UPLCBEH Amide（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）；柱溫：45 °C；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；洗脫梯度為：0 min，1%；4 min，46.5%；10 min，70%；10.5 min，1%；14 min，1%；14.01 min，停止。

1.6 質(zhì)譜條件質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置 離子源：電噴霧離子源（ESI），正負離子模式；源噴霧電壓（ISFV）：-4,500 V；輔助加熱氣溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣(Gas1)：55 psi；輔助氣（Gas2）：55 psi；氣簾氣（CUR）：35 psi；解簇電壓（DP）：90 V；碰撞能（CE）：35。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍：100 Da-1,200 Da；IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍：50 Da-1,000 Da；數(shù)據(jù)采集所用軟件為Analyst TF 1.7 software（AB SCIEX,Foster City,CA）。

1.7 統(tǒng)計學分析

1.7.1 數(shù)據(jù)預處理 UPLC-QTOF-MS采集的原始數(shù)據(jù)利用MarkerView軟件（AB SCIEX公司，美國）進行峰識別、匹配、峰對齊、濾噪等預處理。具體步驟如下：將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導入軟件后，首先進行參數(shù)設(shè)置，峰識別（peak finding）參數(shù)選擇：最小保留時間（minimum retention time）0.01 min，最大保留時間（maximum retention time）10 min或14 min，最小質(zhì)荷比寬度（minimum spectral peak width）30 ppm，最小保留時間寬度（minimum RT peak width）5 scans，噪波閾值（noise threshold）100。峰對齊（alignment）參數(shù)選擇：保留時間容差（retention time tolerance）0.1 min，質(zhì)荷比容差（mass tolerance）10 ppm。濾噪（filering）參數(shù)選擇：去除在少于20個樣本中出現(xiàn)的峰，最大峰數(shù)目8,000。經(jīng)處理后即可得到峰表，峰表主要顯示代謝物的保留時間、m/z等信息，里面有大量缺失值，產(chǎn)生的原因主要有：不存在該峰、峰存在但其檢測值過小以致于不能被正確識別、未在80%以上的同組樣本中出現(xiàn)，故需對其按“80%”原則剔除，再進行峰面積的歸一化處理，即完成對數(shù)據(jù)的標準化預處理。

1.7.2 模型構(gòu)建 利用SIMCA 14.1（瑞典Umetrics AB公司）軟件對標準化的峰表數(shù)據(jù)進行多變量分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過Parato變換后，選用正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis,OPLS-DA）進行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，再進一步通過S-plot及代謝物的VIP值（Variable Importance on Projection，反應(yīng)離子貢獻度）、VIP值置信區(qū)間篩選差異代謝物。

1.7.3 生物標志物的鑒定 生物標志物的鑒定方法主要是根據(jù)誤差范圍內(nèi)分子量及相應(yīng)的二級碎片信息與MassBank、HMDB、Lipidmap、Metlin、Chemspider等網(wǎng)站以及LipidViewTM1.2（AB Sciex,Foster City,CA）所提供的信息的匹配度確定最終結(jié)構(gòu)和其所涉及的相關(guān)代謝途徑。根據(jù)OPLS-DA模型中變量的VIP值進行篩選，變量值＞1被認為該變量對組間區(qū)分有貢獻，同時對VIP＞1.0的代謝物進行單變量統(tǒng)計分析，P＜0.05的代謝物納入差異代謝物范圍，進行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 原始譜圖和數(shù)據(jù) 本實驗應(yīng)用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-QTOF-MS）對A549、A549/DDP細胞的代謝產(chǎn)物進行了檢測分析，得到其原始圖譜，圖1為A549和A549/DDP細胞非極性和極性代謝產(chǎn)物總離子流圖。通過對比，發(fā)現(xiàn)無論是極性代謝層還是非極性代謝層，兩組細胞的譜峰在0.5 min-1.5 min、2 min-5 min的數(shù)量均基本相似，但是有一些峰的強度存在明顯差異。

2.2 A549和A549/DDP組細胞OPLS-DA分析 為考察A549和A549/DDP細胞之間的差異代謝情況，采用OPLS-DA對A549與A549/DDP細胞的極性代謝物層以及A549與A549/DDP細胞的和非極性代謝物層之間進行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，獲得OPLS-DA模型，如圖2所示。對于非極性代謝物模型（圖2A），包含3個主成分，其擬合參數(shù)分別為R2X=0.752、R2Y=0.998和Q2=0.967；而極性代謝物模型（圖2B）包含5個主成分，其擬合參數(shù)分別為R2X=0.928、R2Y=0.999和Q2=0.943，說明圖2A和圖2B模型的穩(wěn)定性和預測率都比較高，適合于可靠解釋A549和A549/DDP組細胞之間的代謝差異和發(fā)現(xiàn)兩組之間的差異性表達代謝物。圖2A和圖2B模型中A549與A549/DDP細胞的極性代謝物層以及A549與A549/DDP細胞的和非極性代謝物層之間能完全分開，說明兩組細胞之間有顯著差異。圖2C和圖2D模型中表明兩種細胞存在多種差異代謝物。

2.3 A549和A549/DDP組之間差異代謝物的鑒定 在A549和A549/DDP極性與非極性組細胞樣品的S-plot圖（圖2）中，代謝物點與原點附近的離子簇距離越遠，則對樣本類別分離的貢獻越大，選擇為潛在的差異代謝物，再進一步篩選出VIP值＞1和P值＜0.05的代謝物作為差異代謝物，并對這些差異代謝物進行結(jié)構(gòu)鑒定，其中，非極性代謝物的鑒定結(jié)果見表1，極性代謝物的鑒定結(jié)構(gòu)見表2。由表中結(jié)果可知，非極性差異代謝物主要為磷脂類成分，包含磷脂酰膽堿（phosphatidyl cholines,PC）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）、磷脂酰乙醇胺（ phosphatidylethanolamine,PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）和鞘磷脂（sphingomyelin,SM），五類成分中發(fā)現(xiàn)的差異代謝物各有11種、2種、5種、4種和6種；極性差異代謝物中主要包括膽堿、天冬氨酸類2種、組氨酸、檸檬酸、肉毒堿3種、泛酸、還原型和氧化型谷胱甘肽。

表1 A549與A549/DDP細胞的非極性代謝差異物鑒定結(jié)果Tab 1 Summary of the differential non-polar metabolites between A549 and A549/DDP cells

圖1 A549和A549/DDP細胞的非極性（A）和極性（B）層提取物的原始譜圖（橫軸表示時間，縱軸表示強度）Fig 1 The original spectrum of (A) non-polar metabolite profile and (B) polar metabolite profile of A549 and A549/DDP cells(X-axis stands for time,Y-axis stands for intensity)

圖2 A549和A549/DDP細胞的非極性（A和C）和極性（B和D）代謝物的OPLS-DA模型圖和OPLS-DA模型S-plot圖Fig 2 OPLS-DA results and S-plot results of non-polar metabolite (A,C) and polar metabolite (B,D) of A549 and A549/DDP cells

表2 A549細胞與A549/DDP細胞的極性代謝差異物鑒定結(jié)果Tab 2 Summary of the differential polar metabolites between A549 cells and A549/DDP cells

3 討論

通過UPLC-QTOF-MS的細胞代謝組學研究方法，對A549與順鉑耐藥細胞A549/DDP進行培養(yǎng)及代謝相提取，并對兩組細胞的內(nèi)源性小分子代謝物進行分析，篩選并鑒定出了29種細胞非極性代謝差異物以及11種細胞極性代謝差異物。

在差異代謝成分中，發(fā)現(xiàn)多數(shù)磷脂類成分在A549和A549/DDP細胞中存在顯著差異，主要包括PC、PS、PE、PI和SM。磷脂是構(gòu)成細胞膜雙分子層結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，除了進行細胞內(nèi)與外界的物質(zhì)交換外，對細胞信號傳導以及蛋白質(zhì)功能也有重要的作用。而不同的細胞膜及其功能基本上可以從其分子結(jié)構(gòu)上解釋，這就與細胞膜中重要的磷脂組成部分的分子結(jié)構(gòu)及所占比例密切相關(guān)。

通常情況下，耐藥性細胞中的藥物累積相對于敏感性細胞會比較低，其主要原因之一是藥物流入的減少，而化療藥物一般都是親脂性的。因此，藥物流入的減少主要歸因于細胞膜的生物和物理性質(zhì)改變。耐藥細胞通常有不同的脂質(zhì)組成，這些變化改變了細胞膜的流動性、滲透性、結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)填充密度、膜電位等基本性質(zhì)，是導致穿過細胞膜流入細胞的藥物減少的主要因素[5]。

除此之外，其他磷脂相關(guān)的生物效應(yīng)同樣對細胞耐藥有重要的影響。膽堿和乙醇胺類磷脂作為其中含量最高最重要的兩類磷脂，已有多項研究[6-8]表明其在腫瘤細胞中的含量以及其相關(guān)代謝酶的表達和活性與正常細胞有顯著差異。磷脂酰絲氨酸是一種有免疫抑制作用的磷脂，通常存在于細胞的膜內(nèi)層。它可以通過結(jié)合免疫細胞的磷脂酰絲氨酸受體，抑制其抗癌免疫效應(yīng)和攻擊效應(yīng)，以此調(diào)控腫瘤細胞的生物進程以及惡性轉(zhuǎn)化。在多種腫瘤細胞（包括乳腺癌、膠質(zhì)瘤等）膜上都可以發(fā)現(xiàn)過量的磷脂酰絲氨酸[9]。而鞘磷脂則是脂質(zhì)筏的重要組成成分，它可以直接參與跨膜蛋白的功能，并為多藥轉(zhuǎn)運蛋白提供最佳的脂質(zhì)微環(huán)境。有研究者提出，腫瘤細胞膜上鞘磷脂含量的提高除了有助于脂質(zhì)筏的延展之外，還可以招募多藥耐藥蛋白結(jié)合于脂質(zhì)筏上，改變細胞膜的流動性，阻礙藥物的攝取，致使細胞產(chǎn)生耐藥性。而磷脂酰肌醇除了參與細胞膜的構(gòu)成外，它在細胞中對于代謝調(diào)控、信號傳導和細胞的各種生理功能起著非常重要的作用[10,11]。因此，在該研究中發(fā)現(xiàn)與膜構(gòu)成相關(guān)的幾種重要磷脂成分（PC、PE、PS、SM和PI）均為兩株細胞之間的差異代謝物，提示針對相應(yīng)的磷脂代謝途徑，可以改變細胞膜的性質(zhì)，并影響所產(chǎn)生的信號傳導和引起的生物效應(yīng)，從而可能改善其耐藥性。

除了磷脂類膽堿外，我們還發(fā)現(xiàn)在耐藥細胞A549/DDP中其他膽堿成分與A549細胞相比同樣也存在明顯差異。早在20世紀末，科學家通過磁共振波譜分析就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)異常的膽堿代謝存在于多種腫瘤中，主要表現(xiàn)為高水平的磷脂酰膽堿和總膽堿。異常的膽堿代謝不僅參與腫瘤的增殖生長，還會促進其惡性轉(zhuǎn)化。因此，膽堿類成分已逐漸被當做是腫瘤診斷和治療的一種重要標志物，并且膽堿代謝的分子機制研究也成為抗腫瘤治療研究的重點[12,13]。已有研究[14,15]在乳腺癌耐藥（吉非替尼）細胞、前列腺癌耐藥（卡鉑）細胞和胰腺癌耐藥（埃羅替尼）細胞中發(fā)現(xiàn)了其膽堿類代謝物的變化。因此，我們的實驗結(jié)果說明膽堿代謝與NSCLC順鉑耐藥性有潛在的相關(guān)性，通過調(diào)控其代謝通路可能會達到逆轉(zhuǎn)其耐藥性的作用。

除此之外，我們同樣在兩種細胞中發(fā)現(xiàn)了多種合成或代謝途徑相關(guān)的差異代謝物。包括參與氨基酸合成代謝的天冬氨酸、組氨酸和泛酸，參與三羧酸循環(huán)和能量代謝的檸檬酸，參與脂質(zhì)代謝和能量代謝的肉毒堿，以及參與磷酸戊糖途徑、谷胱甘肽代謝的還原型和氧化型谷胱甘肽（glutathione,GSH）。通過查閱文獻，我們發(fā)現(xiàn)本實驗結(jié)果與既往研究存在一定的一致性。Schneider等[16]發(fā)現(xiàn)卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780-cis中的ATP基礎(chǔ)水平與敏感性細胞A2780相比明顯提高，并認為這是由于耐藥細胞的能量代謝水平更旺盛的緣故導致，本研究中發(fā)現(xiàn)檸檬酸在兩種細胞中存在明顯差異，暗示了耐藥細胞于敏感細胞的基礎(chǔ)能量代謝可能有所不同。Lee等[17]通過代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細胞T24S與其順鉑耐藥性細胞中的多種脂質(zhì)有顯著性差異，并提出脂質(zhì)代謝重編程與順鉑耐藥性密切相關(guān)的觀點，因此肉毒堿作為脂質(zhì)合成的基本分子，與順鉑耐藥性的關(guān)系不言而喻。順鉑可以損傷細胞內(nèi)線粒體，并使活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）水平升高，導致胞內(nèi)氧化應(yīng)激，GSH是ROS的有效清除劑之一，而且GSH可以與順鉑形成復合物，因此細胞內(nèi)GSH水平的變化是影響順鉑藥效的潛在因素?，F(xiàn)已有研究[18,19]發(fā)現(xiàn)，抑制6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose 6-phosphatedehydrogenase,G6PD）可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌，肺癌的順鉑耐藥性細胞，G6PD催化反應(yīng)所產(chǎn)生的的NADPH是生成還原性GSH的重要還原劑。此外，作為GSH代謝途徑的主要上游調(diào)控基因，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nf-E2 related factor-2,Nrf2）被發(fā)現(xiàn)對順鉑的耐藥性也有影響[20]，說明谷胱甘肽等維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的分子是順鉑藥效發(fā)揮的重要影響因素。而對于氨基酸的主要代謝物與順鉑的療效的相關(guān)研究則較為缺乏，目前僅有研究[21]發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸對于順鉑的腎毒性能發(fā)揮有效的緩解作用。因此這一方面的研究需要深入探討。重編程一直是腫瘤靶向研究的熱點，通過靶向不同腫瘤與正常組織或細胞相異的代謝通路，來達到抗腫瘤的目的并獲取有效的治療方法[22]。這種方法同樣適用于解決腫瘤耐藥的問題，通過影響代謝通路，使細胞的生理狀態(tài)產(chǎn)生影響，使其對化療藥物更為敏感，不僅如此，化療藥的作用機制也可能部分通過代謝機制來完成，這可能更有利于增敏及逆轉(zhuǎn)耐藥。

綜上，本實驗通過對A549細胞及其順鉑耐藥細胞A549/DDP的代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)磷脂類成分以及部分代謝相關(guān)物質(zhì)為兩種細胞的差異代謝物，但其確證還需要進行進一步相關(guān)的體內(nèi)外實驗，希望能夠為逆轉(zhuǎn)NSCLC順鉑耐藥性提供有效的參考和依據(jù)。