李娟,陳中華,華梅,原曉龍,虞泓,王毅

(1.云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實驗室,云南 昆明650091;2.國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室,云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室,云南 昆明650201;3.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明650201)

植物內(nèi)生真菌是一類在宿主植物的健康組織內(nèi)完成整個或部分生活周期,但不引起寄主植物產(chǎn)生明顯疾病癥狀的真菌[1]。幾乎所有植物體內(nèi)均有內(nèi)生真菌的存在[2]。在健康植株中,內(nèi)生真菌和其寄主植物通常是互惠共生的。植物為內(nèi)生真菌提供營養(yǎng)和舒適的環(huán)境,有些內(nèi)生真菌能促進寄主植物的生長并提高植物對生物逆境和非生物逆境的耐受性[3-4]。草本植物中的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生具有毒性的生物堿,從而保護寄主不被食草動物取食[5]。香柱菌屬 (Epichloe)一內(nèi)生真菌新種 (Epichloe gansuensis),可以抑制醉馬草 (Achnatherum inebrians)上禾本科布氏白粉菌 (Blumeria graminis)的定殖[6]。牧草內(nèi)生菌產(chǎn)生的毒麥堿對鄰近植物有較強的化感作用。面對非生物脅迫,植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物,提高寄主對干旱、高溫、高鹽、重金屬等脅迫的耐受性。由于植物內(nèi)生真菌生存環(huán)境的多樣性以及種類的多樣性,決定了植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的多樣性。研究表明,從植物中分離得到的內(nèi)生真菌可產(chǎn)生多種活性物質(zhì),多具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、免疫抑制、抗氧化和降糖等活性,其中有一些是具有特殊活性的新物質(zhì)[7]。如短葉紫杉 (Taxus brevifolia)的樹皮中分離出產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌 (Taxomyces andreanae)能產(chǎn)生抗乳腺癌、子宮癌、卵巢癌的化合物紫杉醇 (taxol)[8]。從蛇足石杉 (Huperzia serrata)的內(nèi)生菌 (Penicillium chrysogenum P1X)中分離得到9種具有較罕見C25類固醇骨架的抗菌甾體類化合物[9]。

目前臨床上抗生素的大量使用,使許多致病細菌的耐藥性不斷增強,根據(jù)2012年中國CHINET細菌耐藥性檢測報道,耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌 (MRCNS)的檢出率平均為77.1%;大腸埃希菌 (Escherichia coli)對環(huán)丙沙星、慶大霉素和哌拉西林的耐藥率均接近或高于50.0%[10]。耐藥菌感染已嚴重危害人類健康,尋找新的抗菌藥物來代替抗生素已迫在眉睫。植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)多數(shù)是新化合物,因此,有望從中尋找到新的抗生素。例如,從紅樹林植物鹵蕨 (Acrostichum aureurm)中分離得到的內(nèi)生真菌 (Penicillium sp.0935030)能產(chǎn)生兩種抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)的環(huán)肽化合物[11]。從雞冠刺桐(Erythrina crista-galli)的內(nèi)生真菌 (Phomopsis sp.)發(fā)酵液中獲得的一個新抗生素Phomol對24種細菌和真菌都顯示出很好的抗菌活性[12]。

目前,雖然已從其他植物中分離獲得具有許多生物活性的內(nèi)生真菌,但對云南珍稀瀕危植物蒜頭果 (Malania oleifera)內(nèi)生真菌的活性研究還未見報道。單菌多產(chǎn)物 (OMSAC)策略主要是通過改變培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法等手段,激活微生物中沉默基因,以產(chǎn)生大量具有活性的代謝產(chǎn)物,為新型藥物的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物[13]。因此,本研究從我國特有的單屬種植物,鐵青樹科 (Olacaceae)蒜頭果屬 (Malania)的蒜頭果中分離獲得植物內(nèi)生真菌,使用OMSAC策略進行發(fā)酵,并檢測其發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性,以期為蒜頭果內(nèi)生真菌的統(tǒng)合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙曲霉菌種 (Aspergillus fumigatus)從蒜頭果植株中分離獲得,經(jīng)ITS及形態(tài)鑒定后,保存在云南省林業(yè)科學(xué)院,國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物繁育和保護重點實驗室,菌株編號為MOEF013。供試6種人體致病細菌分別為蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus)、副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)、無乳鏈球菌 (Streptcococcus agalactiae)、福氏志賀氏菌 (Shigella flexneri)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌 (Micrococcus luteus)。由昆明市食品藥品檢驗所贈送。

1.2 不同液體培養(yǎng)基的配制

OMAM培養(yǎng)基 蔗糖 (20g/L)與葡萄糖(20g/L)為碳源,酵母粉 (1g/L)和大豆蛋白胨(20g/L)為氮源。

不同氮源的培養(yǎng)基 麥芽糖 (1.8g/L)與葡萄糖 (6g/L)為碳源,編號為M與G,分別以4g/L的麥芽浸粉 (M1)、酵母粉 (Y2)、番茄浸粉(T)、馬鈴薯浸粉 (P)、大豆蛋白胨 (S)、胰蛋白胨 (Y1)、牛肉浸粉 (B)、酪蛋白胨 (L)和香蕉粉 (B1)為氮源,配制成碳源相同氮源不同的液體培養(yǎng)基,編號分別為 MGM1、MGY2、MGT、MGP、 MGS、 MGY1、 MGB、 MGL、 MGB1。

不同碳源的培養(yǎng)基 麥芽浸粉 (6g/L)與酵母粉 (3g/L)為氮源,分別以4g/L的甘露醇、麥芽糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、肌醇、果糖、可溶性淀粉為碳源,配制成氮源相同碳源不同的液體培養(yǎng)基,編號分別為man、mal、sor、suc、luc、 glu、 ino、 fru、 sta。

1.3 OSMAC策略尋找最佳培養(yǎng)條件

不同條件下分別培養(yǎng)MOEF013,對其不同的提取物做活性檢測,具體為無菌條件下,研碎煙曲霉菌體;不同接種量為研碎15mg、30mg、60mg、90mg、120mg菌體各一份,在OMAM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng);不同培養(yǎng)條件為接種到OMAM培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)5d后,分別加入細菌共培養(yǎng)、周期性改變培養(yǎng)溫度 (15℃與28℃交替改變,每12h改變一次)、共培養(yǎng)的同時改變培養(yǎng)溫度3種條件下再培養(yǎng)5d;不同培養(yǎng)基分別接種到不同碳源和不同氮源的液體培養(yǎng)基中,28℃,150r/min搖床培養(yǎng)10d。

收獲培養(yǎng)物完全干燥后加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)制備成50mg/mL提取物的DMSO溶液,備用。

1.4 提取物抗菌活性檢測

致病細菌懸浮液的制備 分別接種6種檢測細菌于LB固體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)12h后,挑取單菌落接種到5mL液體LB培養(yǎng)基中,搖床37℃,180r/min培養(yǎng)至菌液濃度達到1×106-6×106cfu/mL,備用。

抑菌實驗采用紙片法 將各檢測菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上,略干后將加有10μL提取物的濾紙片 (φ=5mm)放置在含有檢測菌的培養(yǎng)基上,10μL DMSO作為陰性對照,37℃恒溫培養(yǎng)24h后測量抑菌圈大小。每個菌種重復(fù)3次實驗。

測定最小抑菌活性 (MIC) 采用二倍稀釋法,測定具有活性提取物的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度

檢測MOEF013提取物對6種人體致病菌的抗菌活性,結(jié)果顯示,提取物對蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、無乳鏈球菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌具有良好的抗菌活性。二倍稀釋法測定MOEF013發(fā)酵提取物對6種致病菌的MIC(表1),提取物對副溶血性弧菌和藤黃微球菌抑菌效果較好,最低抑菌濃度為6.25mg/mL,金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、福氏志賀氏菌最低抑菌濃度為12.5mg/mL。蠟樣芽孢桿菌的MIC值為25.0mg/mL,說明蠟樣芽孢桿菌對煙曲霉提取物敏感性較低。

表1 MOEF013提取物對6種致病菌的MICTab.1 The minimum inhibitory concentration of MOEF013 extracts to 6 kinds of pathogenic bacteria

圖1 MOEF013提取物對藤黃微球菌的MICFig.1 MIC of MOEF013 extracts to Micrococcus luteus

2.2 接種量對煙曲霉抑菌活性的影響

按照不同接種量培養(yǎng)MOEF013菌株10d后收獲其代謝產(chǎn)物,乙酸乙酯提取后測定抑菌活性。結(jié)果顯示,不同接種量對抑菌活性沒有影響,但對產(chǎn)物的提取量有明顯影響 (圖2)。

圖2 接種量對MOEF013次生代謝產(chǎn)物提取量的影響Fig.2 Influence of inoculation quantity on the extraction of secondary metabolites from MOEF013

由圖2可以看出,隨著接種量的增加,提取量逐漸增加,當(dāng)接種量為60mg時,提取量最高,接種量大于60mg時,提取量逐漸下降。

2.3 共培養(yǎng)和培養(yǎng)溫度變化對MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性的影響

通過周期性改變培養(yǎng)溫度、與細菌共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)煙曲霉提取物抑菌活性有所變化 (表2)。相比對照組,溫度變化后煙曲霉提取物除對無乳鏈球菌抗菌效果不變,對藤黃微球菌抗菌效果略微下降外,對其余4種致病菌的抗菌活性都有所增強。加入細菌共培養(yǎng)后對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的抗菌活性有所增強,但對副溶血性弧菌、無乳鏈球菌、福氏志賀氏菌的抗菌活性下降。共培養(yǎng)并改變溫度后對蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、福氏志賀氏菌3種致病菌的抗菌效果有所增強,但對無乳鏈球菌、藤黃微球菌的抗菌效果減弱,對金黃色葡萄球菌沒有影響。

表2 共培養(yǎng)和溫度變化對MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性影響Tab.2 Influence of co-culture and temperature changes on the antibacterial activity of secondary metabolites from MOEF013

2.4 不同培養(yǎng)基對MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響

2.4.1 不同氮源對MOEF013提取物抑菌效果的比較

MOEF013在9種不同氮源培養(yǎng)基中培養(yǎng)后經(jīng)乙酸乙酯萃取所得提取物對6種致病細菌的抑菌效果差別較明顯 (圖3)。可以看出不同培養(yǎng)基對MOEF013的次生代謝產(chǎn)物有影響。其中MGY1和MGP培養(yǎng)基培養(yǎng)MOEF013產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對6種致病菌抗菌活性均較好。但MGP培養(yǎng)基培養(yǎng)下提取物的收獲量 (31.2mg)比MGY1培養(yǎng)基的收獲量 (17.1mg)更高,所以確定馬鈴薯粉為培養(yǎng)蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉的最佳氮源。此外,不同氮源下提取物對不同致病菌的抗菌效果也有差異。除提取物MGM1對金黃色葡萄桿菌沒有抗菌活性,MGS提取物對金黃色葡萄桿菌和福氏志賀氏菌沒有抗菌活性外,其余氮源所獲得提取物對6種致病細菌均有抗菌活性。MGL提取物對金黃色葡萄球菌抗菌效果最好,抑菌圈直徑達19mm。MGB1提取物對藤黃微球菌抗菌效果較其他氮源都好。副溶血性弧菌對MGY1,MGM1,MGB1提取物較敏感(圖4)。

圖3 不同氮源培養(yǎng)基下MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性比較Fig.3 Antibacterial activity of MOEF013 secondary metabolites in different nitrogen sources

圖4 不同氮源培養(yǎng)基發(fā)酵提取物對副溶血性弧菌抑菌效果Fig.4 Antibacterial activity of MOEF013 extracts in different nitrogen sources to Vibrio parahaemolyticus

2.4.2 不同碳源對MOEF013提取物抑菌效果的比較

分別在9種不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)MOEF013后所得提取物對6種致病細菌的抑菌效果有差異(圖5)。

圖5 不同碳源培養(yǎng)基下MOEF013次生代謝產(chǎn)物抑菌活性比較Fig.5 Antibacterial activity of MOEF013 secondary metabolites in different carbon sources

glu為碳源的提取物對6種致病菌均有抑菌活性。mal為碳源的提取物對5種致病細菌有抑菌活性,尤其對副溶血性弧菌抑制效果顯著,但對福氏志賀氏菌沒有抑菌活性。suc培養(yǎng)基所獲提取物對除藤黃微球菌外的5種致病菌均有抗菌效果,對無乳鏈球菌抗菌效果較明顯。man和sor提取物對4種致病菌有抗菌活性,對藤黃微球菌和福氏志賀氏菌沒有活性。luc為碳源所獲提取物對蠟樣芽胞桿菌和福氏志賀氏菌沒有抗菌活性,對其余致病菌均有抑制效果。fru提取物對藤黃微球菌和福氏志賀氏菌沒有抑制效果。sta為碳源的提取物對蠟樣芽胞桿菌和無乳鏈球菌沒有抑菌作用。ino為碳源所獲得提取物抗菌活性較差,僅對蠟樣芽胞桿菌和副溶血性弧菌有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

蒜頭果為我國特有植物,被列為國家二級重點保護植物,僅分布于我國云南東南部至廣西西部的狹窄地帶,不僅分布極其狹窄,且現(xiàn)存資源量十分稀少[14]。本研究從蒜頭果樹皮中成功分離獲得植物內(nèi)生真菌—煙曲霉,對其內(nèi)生真菌煙曲霉發(fā)酵后提取物的抗菌活性進行檢測,發(fā)現(xiàn)它對6種人體致病細菌 (蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、無乳鏈球菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌)均有抑菌活性,其中對副溶血性弧菌、藤黃微球菌最低抑制濃度達到6.25mg/mL。植物內(nèi)生真菌與宿主植物的共生關(guān)系是經(jīng)歷了漫長的進化過程后相互適應(yīng)的結(jié)果,其代謝產(chǎn)物的種類與其宿主植物也息息相關(guān)[15]。不同屬的植物因其內(nèi)環(huán)境的不同,故寄生于不同屬植物的同屬內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物也會有所不同。例如從禾本科 (Gramineae)植物狗牙根 (Cynodon dactylon)中獲得的內(nèi)生真菌(Aspergillus sp.)能產(chǎn)生3種具抗菌活性的甾類化合物,而從紅豆杉 (Taxus mairei)植物中獲得的內(nèi)生真菌 (Aspergillus clavatonanicus)能產(chǎn)生對多種植物病原菌都有抑制作用的內(nèi)酯化合物 patulin[16]。此外,植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物也受到發(fā)酵條件的影響。林淑婷等發(fā)現(xiàn),不同發(fā)酵條件下,海南粗榧 (Cephataxus hainanensis Li.)中一種內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物種類和產(chǎn)量均有明顯差異[17]。因此,本報道通過OSMAC策略,探究了我國瀕危特有物種蒜頭果內(nèi)生真菌MOEF013菌株的最佳發(fā)酵條件,尋找到使其代謝產(chǎn)物活性最好、產(chǎn)量最高的培養(yǎng)條件,在該條件下,MOEF013菌株次生代謝產(chǎn)物對蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、無乳鏈球菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌均有良好的抑菌作用。在以往的文獻中,僅見到煙曲霉次生代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌 (Candida albicans)抑菌活性的報道[18-20]。由新的抗菌活性可以推測,蒜頭果內(nèi)生真菌MOEF013菌株在一定條件下可能產(chǎn)生了新的抗菌化合物。

此外,本研究發(fā)現(xiàn)MGM1培養(yǎng)基發(fā)酵下所得提取物對副溶血性弧菌抑菌效果較好,但對金黃色葡萄球菌沒有抑菌效果,而MGL所得提取物對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯優(yōu)于其他致病菌,因此可以推斷,蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉所產(chǎn)生的抗菌成分不止一種。類似的情況在其他微生物中也存在,如謝海平等發(fā)現(xiàn)海洋枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)Bs-1在PDA培養(yǎng)基中發(fā)酵至少產(chǎn)生3種抗真菌活性化合物[21]。綠僵菌 (Metarhizium anisopliae)除了能產(chǎn)生具有抗菌效果的煙曲霉酸 (helvolic acid),還能產(chǎn)生一種煙曲霉酸的衍生物 (1,2-dihydrohelvolic acid)[22]。但本研究中所用的樣品僅為蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉的發(fā)酵液粗提物,對于起到抗菌作用的究竟有幾種化合物、分別是什么化合物還有待進一步的鑒定和研究。在今后的研究中,將大量發(fā)酵蒜頭果內(nèi)生真菌煙曲霉,對其提取物進行分離、純化、鑒定等進一步研究,確定提取物中抗菌活性成分,并深入研究其抗菌的機制,以期為新型抗菌藥物提供先導(dǎo)化合物。