謝正萬,寧德魯,周軍,吳濤,肖良俊,陳海云

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,云南 昆明650224;2.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明650201)

草果 (Amomum tsao-ko)是姜科 (Zingiberaceae)豆蔻屬 (Amomum Roxb.)植物,主產(chǎn)于廣西、云南、貴州等地,具有燥濕除寒、除痰、消食化食的功效,主治瘧疾、小腹冷痛、瀉痢、吐逆等[1]。全球約有150多種豆蔻屬植物,中國有24種,分布在熱帶區(qū)域。云南是國內(nèi)草果的主產(chǎn)地,主要產(chǎn)于云南西南部的保山騰沖和普洱市的瀾滄,東南部的紅河州金平縣、屏邊縣、綠春縣和元陽縣,以及文山州的馬關(guān)縣、麻栗坡縣和西疇縣,西部的德宏州隴川、盈江兩縣,西北部的玉溪新平縣,怒江州瀘水縣、福貢縣和貢山縣等地[2]。草果既是一種調(diào)味品,又可作藥材使用,盡管近年來需求量越來越大,但其產(chǎn)量較低。目前,草果的研究主要集中于化學(xué)成分和藥理等方面。如Yang等[3]利用水蒸氣蒸餾法從草果中提取出揮發(fā)油,并從中鑒定出了73種成分;吳燕飛等[4]利用超臨界CO2流體 (SFE-CO2)萃取的方法得到了草果油,并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC/MS)鑒定出了32種成分;草果揮發(fā)油對(duì)黃曲霉等6種霉菌有很明顯抑菌作用[5]。雖然我國草果的栽培歷史已經(jīng)有200多年,但因?yàn)槲催M(jìn)行專門的種質(zhì)資源的分類整理,草果的栽培品種混亂,從而導(dǎo)致草果產(chǎn)量不高[6]。因此,研究草果的遺傳多樣,掌握草果種質(zhì)資源的遺傳背景和親緣關(guān)系,為草果的種質(zhì)資源開發(fā)與利用提供信息,這是非常有必要的。但是近年來,對(duì)草果分子方面的研究甚少,僅見嚴(yán)美榮[7]利用SSR技術(shù)對(duì)草果的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。

RAPD(Random amplified polymorphism DNA)(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)于1990年創(chuàng)建,該技術(shù)以其流程簡單、安全快速、花費(fèi)不高、多態(tài)性豐富、適應(yīng)性廣、無需同位素等優(yōu)點(diǎn),在遺傳多樣性分析、外源DNA的快速鑒定等方面得到了普遍應(yīng)用[8-10]。利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)時(shí),所用的引物是隨機(jī)引物,因此首先需要對(duì)引物進(jìn)行篩選[11]。本實(shí)驗(yàn)以12份草果為材料,利用RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)192個(gè)RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行了篩選,為今后利用RAPD技術(shù)對(duì)草果進(jìn)行遺傳多樣性分析等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為云南省文山州西疇縣和德宏州隴川縣的12株優(yōu)良無性系,株齡6-8年 (表1)。采集草果新鮮無病蟲害的嫩葉,保存在盛有硅膠的自封袋里使其脫水干燥,用于提取DNA。

表1 12份供試材料來源Tab.1 The origins of 12 tested materials

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取

利用植物DNA提取試劑盒 (康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)提取草果基因組DNA,然后用0.8%的瓊脂糖凝膠對(duì)DNA進(jìn)行電泳檢測其質(zhì)量,放在-20℃下保存,備用。

1.2.2 引物篩選及PCR擴(kuò)增

供試的192個(gè)RAPD引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供,每套有20個(gè)引物,分別為A1-A20、B1-B20、 C1-C20、 D1-D20、 E1-E20、 F1-F20、 G1-G20、H1-H20、M1-M20、N1-N12。從 12份草果樣品的DNA溶液中分別取30μL,混合后作為混合模板用來進(jìn)行引物篩選。篩選出條帶清晰、有差異的條帶和重復(fù)性好的引物。25μL的RAPD-PCR反應(yīng)體系中包括2×Taq MasterMix(康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)12.5μL,DNA 模板 1μL(50ng),10mM/L引物1.0μL,ddH2O補(bǔ)足。PCR儀型號(hào)為TProfessional Standard Gradient 96(Biometra,德國)。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min;94℃變性30s,40℃退火40s,72℃延伸30s,共40個(gè)循環(huán);72℃延伸5min;4℃保存。最后所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物需要用2%的瓊脂糖凝膠來進(jìn)行電泳分離,然后用溴化乙錠 (EB)染色20min,最后用凝膠成像儀(百晶)拍攝圖像。

1.2.3 PCR擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)和分析

根據(jù)所得電泳圖譜,統(tǒng)計(jì)清晰的DNA條帶,以及可重復(fù)性弱帶,記為1,而在相同位置上沒有條帶的記為0,最終得到0和1的原始矩陣。為了分析所測樣品的遺傳相似性,利用NTSYS-pc軟件計(jì)算其遺傳相似系數(shù) (genetic similarity,GS),然后通過UPGMA方法進(jìn)行聚類分析,并用Tree plot程序生成系統(tǒng)樹圖。根據(jù)記錄結(jié)果,分別統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增出來的DNA總帶數(shù),以及其中包含的多態(tài)性帶數(shù),然后計(jì)算多態(tài)性帶百分率 (percentage of polymorphic bands,PPB),PPB=多態(tài)性帶數(shù)/擴(kuò)增帶總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)選用192個(gè)RAPD隨機(jī)引物,分別對(duì)12個(gè)草果樣品的混合DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最后篩選出21個(gè)RAPD引物 (表2)。圖1展示了G1-G20和H1-H4共24個(gè)引物篩選的結(jié)果。

表2 篩選出的RAPD引物及序列信息Tab.2 Primers screened in this study and their sequences

圖1 部分引物篩選時(shí)的RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification using parts of RAPD primers

為驗(yàn)證所得引物是否有效,分別用21個(gè)引物對(duì)本次實(shí)驗(yàn)所選12份草果樣品進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,這些引物的擴(kuò)增圖譜條帶清晰、重復(fù)性好且在12份樣品中具有多態(tài)性,說明所得引物是有效、可靠的。圖2為12份草果樣品的在引物A17和B01下的RAPD-PCR擴(kuò)增圖譜。

圖2 引物A17(左)和B01(右)的RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification using RAPD primers with SBSA17(Left)and SBSB01(Right)

2.2 RAPD標(biāo)記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及擴(kuò)增結(jié)果

21個(gè)RAPD引物擴(kuò)增條帶結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表3。由表3可知,21個(gè)引物共得到177條帶,其中多態(tài)性帶有119條,占擴(kuò)增總帶數(shù)的67.2%,每個(gè)引物平均得到8.4條帶和5.7條多態(tài)性帶。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),用這21個(gè)引物擴(kuò)增得到的DNA總條帶數(shù)與多態(tài)性帶數(shù)之間差異比較大,擴(kuò)增出條帶數(shù)最多的引物是SBSH01和SBSM18,都有12條,而擴(kuò)增出條帶數(shù)最少的引物是SBSA15,擴(kuò)增出的條帶僅有4條;多態(tài)率最高的引物為SBSF17,達(dá)到90%,最低的為SBSB10,僅有14.3%。

表3 21個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果Tab.3 The RAPD amplified result with 21 primers

2.3 12份樣品的遺傳相似系數(shù)及聚類結(jié)果

利用NTSYS-pc軟件來計(jì)算草果間遺傳系數(shù)(GS),最終得到12份草果材料之間的遺傳相似系數(shù)表 (表4)。由表4可以看出,12份草果樣品間的GS值變化范圍為0.559 3-0.898 3,平均GS值為0.733 1。在所有樣品中,06號(hào)樣品和11號(hào)樣品之間的GS值最小,為0.559 3,說明這兩種樣品之間的遺傳差異最大;而11號(hào)樣品和12號(hào)樣品之間的GS值最大,為0.898 3,兩樣品之間的遺傳差異最小。12個(gè)樣品中,01和02,02和03,03和07,05和06、07,06和08,07和08,09和10、12,10和11、12,11和12遺傳相似系數(shù)都較大,均大于或等于0.800 0。

表4 12份供試草果樣品的遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic similarity of twelve tested materials of Amomum tsao-ko

據(jù)前面所得的草果遺傳相似系數(shù)矩陣,利用UPGMA法構(gòu)建了12份草果樣品之間的遺傳關(guān)系系統(tǒng)樹 (圖3)。從系統(tǒng)樹狀圖中可得12份樣品聚為A組和B組,其中A組又可分兩個(gè)亞組。A組包括西疇縣小橋溝的全部8個(gè)樣品,其中01-04這4份優(yōu)良無性系為一個(gè)亞組,09-12這4份優(yōu)良單株為另一個(gè)亞組,并且11和12這兩份優(yōu)良單株的遺傳關(guān)系最近;B組包括隴川縣4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的全部4個(gè)樣品 (05-08)。

圖3 12份草果樣品遺傳關(guān)系樹狀圖Fig.3 Dendrogram of 12 populations of Amomum tsao-ko constructed using UPGMA cluster analysis(NTSYS)

3 結(jié)論與討論

本次實(shí)驗(yàn)用12份草果樣品作為供試材料,最終從192個(gè)RAPD隨機(jī)引物中成功篩選出21個(gè)有效引物。PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中21個(gè)引物共得到177條DNA條帶,其中多態(tài)性帶占了67.2%。這為以后用RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì)草果的遺傳多樣性進(jìn)行研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

本研究利用這21個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果按UPGMA法進(jìn)行聚類分析,最后得到的聚類分析結(jié)果將這12份草果樣品分為A組和B組。所得結(jié)果很好地對(duì)應(yīng)了西疇縣和隴川縣的8份和4份草果樣品,能夠較好地將草果材料根據(jù)地理來源進(jìn)行區(qū)分。說明所篩選得到的21個(gè)RAPD引物適宜用來分析研究草果的遺傳多樣性。

該研究中草果的PPB為67.2%,遠(yuǎn)高于豆蔻屬的砂仁 (Amomum villosum,PPB=40.74%)[12],姜科的溫郁金 (Curcuma wenyujin,PPB=31.7%[13],與姜科的姜黃 (Curcuma longa,PPB=67%)[14]和姜 (Zingiber officinale,PPB=64.91%)[15]相近。研究結(jié)果初步表明,草果的遺傳多樣性較為豐富,為下一步優(yōu)良單株選育和新品種雜交育種的親本選擇提供了基本的理論依據(jù)。

草果的近緣植物有野草果A.koenigii、擬草果A.paratsaoko等。紅草果 (A.hongtaoko)為草果的異名。在我國,共有3種豆蔻屬植物被當(dāng)作草果使用,即分布于云南的草果;產(chǎn)于廣西、云南的擬草果及產(chǎn)于廣西、云南的野草果[16]。近幾年來擬草果、野草果以及草豆蔻 (A.katsumadai)因?yàn)樵谕庥^和性狀方面與草果很相似[17],因此摻假現(xiàn)象也就比較嚴(yán)重,而通過查閱資料,發(fā)現(xiàn)近年來對(duì)草果及其混淆品的鑒定從其性狀特征上研究的比較多,如羅曉霞[18]、余南才等[19]、高學(xué)昌[20]從草果的性狀特征方面對(duì)草果和其混淆品擬草果、草豆蔻、砂仁進(jìn)行了比較鑒別,而分子方面的僅有嚴(yán)美榮[7]利用ITS序列差異方法對(duì)草果和擬草果進(jìn)行了鑒定。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)普遍應(yīng)用于物種親緣關(guān)系鑒定方面,為果樹品種鑒定等工作開辟了一條新路,本文采用RAPD技術(shù)篩選出了適合用在草果遺傳多樣性分析上的有效引物,這為草果以后的分子鑒定等研究奠定了一定基礎(chǔ)。本研究僅做了草果分子鑒定方面的引物篩選,如需對(duì)云南省內(nèi)分布的草果資源進(jìn)行全面的了解,還要對(duì)草果的資源分布進(jìn)行全面細(xì)仔地調(diào)查,并進(jìn)行分子水平上的遺傳多樣性的聚類分析,利用聚類結(jié)果分析出不同種源地之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的育種材料為親本,以選育出更為優(yōu)勢、更符合云南當(dāng)?shù)匕l(fā)展的草果優(yōu)良品種。