楊 波，劉麗爽，吳小華，梁 軍

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，是病死率和復(fù)發(fā)率高而治療方案選擇性很小的實(shí)體瘤之一[1]。2012年，全世界約23萬女性確診為卵巢癌，約15萬人死于卵巢癌[2]。卵巢癌早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已是臨床晚期。盡管該病的手術(shù)及化療方案很明確，但其5年生存率仍<30%[3]。miRNA是一類長19～24 nt的非編碼微小RNA，與靶基因的3' 末端結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]。miRNA參與卵巢癌的很多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等。本實(shí)驗(yàn)通過檢測miRNA-3198、miRNA-7515、miRNA-8084和miRNA-3613-3P在初治卵巢癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶、復(fù)發(fā)卵巢癌和卵巢上皮性良性腫瘤組織中的表達(dá)情況，比較各組表達(dá)差異，并探討其差異性表達(dá)可能的機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)miRNA在卵巢癌的發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中的作用，為卵巢癌的診治提供新的方向?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 無菌條件下收集在解放軍白求恩國際和平醫(yī)院婦產(chǎn)科從2010年10月—2016年11月手術(shù)的病理組織，共60例：初治卵巢癌原發(fā)灶組織(A組)15例、初治卵巢癌轉(zhuǎn)移灶組織(B組)15例、復(fù)發(fā)卵巢癌組織(C組)16例和卵巢上皮性良性腫瘤組織(D組)14例。所有組織置于-80℃冰箱冷藏。所有初治卵巢癌患者手術(shù)前均未行任何相關(guān)手術(shù)及輔助治療。所有復(fù)發(fā)卵巢癌患者滿足二次減滅術(shù)適應(yīng)證。所有組織均有術(shù)后病理確診。A組年齡(41～67)歲，中位年齡55歲；初治卵巢癌的臨床分期、病理分型及組織分級(jí)見表1。B組與A組為同一組病例，其中轉(zhuǎn)移灶分別為：表面腹膜3例(結(jié)腸、直腸、膀胱各1例)、脾組織1例和大網(wǎng)膜組織11例。C組年齡(33～68)歲，中位年齡61歲。第一次和第二次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)術(shù)后病理分型及組織分級(jí)見表2。D組年齡為(20～58)歲，中位年齡41歲；黏液性囊腺瘤10例，漿液性囊腺瘤4例。見表1、2。

表1 A組初治卵巢癌的臨床分期、病理分型及組織分級(jí)(例)

注：△為卵巢癌FIGO手術(shù)病理分期(2014年);*為組織分級(jí)

表2 C組復(fù)發(fā)卵巢癌第一次和第二次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)術(shù)后病理分型及組織分級(jí)(例)

1.2實(shí)驗(yàn)方法 先設(shè)計(jì)與合成引物：由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。再分別提取4組組織中的miRNA，對(duì)miRNA 3' 末端進(jìn)行加Poly(A)處理及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，形成cDNA，最后再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測。

2 結(jié)果

2.1miRNA-3198在4組中表達(dá)情況的比較 4組中miRNA-3198的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.32，P<0.001)。兩兩比較：B組低于A、C、D組，A、C組低于D組(P<0.05)；A組與C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表3。

2.2miRNA-7515在4組中表達(dá)情況的比較 4組中miRNA-7515的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.23，P<0.001)。兩兩比較：D組miRNA-7515高于A、B、C組(P<0.05)；而A、B、C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表3。

2.3miRNA-8084在4組中表達(dá)情況的比較 4組中miRNA-8084的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.70，P<0.001)。兩兩比較：D組miRNA-8084高于A、B、C組(P<0.05)；而A、B、C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表3。

2.4miRNA-3613-3P在4組中表達(dá)情況的比較 4組miRNA-3613-3P的表達(dá)水平不全相同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.81，P<0.001)。兩兩比較：B、C組miRNA-3613-3P低于A、D組(P<0.05)；B組與C組、A組與D組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖1、表3。

表3 四種miRNA在卵巢上皮腫瘤中表達(dá)情況的比較

注： A組為初治卵巢癌原發(fā)灶，B組為初治卵巢癌轉(zhuǎn)移灶，C組為復(fù)發(fā)卵巢癌，D組為卵巢上皮性良性腫瘤組織；與A組比較，aP< 0.05；與C組比較，cP< 0.05；與D組比較，eP<0.05

3 討論

在初治卵巢癌原發(fā)灶中miRNA-3198、miRNA-7515和miRNA-8084的表達(dá)水平均低于卵巢上皮性良性腫瘤。研究表明，miRNA在腫瘤組織或細(xì)胞中低表達(dá)，其通過調(diào)節(jié)靶基因抑制腫瘤細(xì)胞增殖。miRNA-217、miRNA-1271高表達(dá)分別抑制IGFIR、CCNG1，從而抑制卵巢癌細(xì)胞生長；但二者在卵巢癌中均呈低表達(dá)[5-6]。miR-302b與miR-498在卵巢癌中均呈低表達(dá)，前者高表達(dá)下調(diào)RUNX1致STAT信號(hào)通路失活，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期；后者高表達(dá)下調(diào)cyclin D1從而阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，二者均可達(dá)到抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的目的[7-8]。因此，miRNA-3198、miRNA-7515和miRNA-8084可能抑制卵巢癌的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，在初治卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中miRNA-3198表達(dá)水平均低于卵巢上皮性良性腫瘤，初治卵巢癌轉(zhuǎn)移灶低于原發(fā)灶。目前尚無關(guān)于miRNA-3198作用機(jī)制的報(bào)道。miRNA-3198的同族基因miRNA-4309，在發(fā)作性睡病患者中高表達(dá)，其可能有降調(diào)TAC1、PENK、SOCS2和CPT1B的作用[9]。SOCS2作為SOCS家族成員之一，可激活JAK / STAT的反饋回路，負(fù)性調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子[10]。在卵巢癌中，miRNA-572可抑制SOCS1和p21，增加Cyclin D1，縮短G1/G0階段，加速S期，從而增強(qiáng)SKOV3 和OVCAR3細(xì)胞的生長能力，增加克隆代數(shù)，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。既往研究表明，低表達(dá)的SOCS1減弱STATs活性，使JAK-STAT信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)受到抑制[12]。因此，miRNA-3198可能是通過增加SOCS1/SOCS2的表達(dá)，激活JAK-STAT信號(hào)通路，抑制了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，在初治卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中miRNA-7515的表達(dá)水平均低于卵巢上皮性良性腫瘤。在肺癌細(xì)胞株中，miRNA-7515下調(diào)c-Met，一方面減少p-Rb、CDK2、cyclin E等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白；另一方面減少c-Met下游的p-ART、p-Erk1/2，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)力和遷移能力[13]。c-Met由c-Met原癌基因編碼，有多功能跨膜酪氨酸激酶活性，與細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)性和侵襲性有關(guān)。在卵巢癌中miRNA-199a-3p低表達(dá)，其高表達(dá)抑制c-Met磷酸化，減少ERK、AKT，抑制MAPK-PI3K信號(hào)通路，從而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞粘附性和細(xì)胞侵襲能力[14]。因此，miRNA-7515可能是通過抑制c-Met的表達(dá)，抑制MAPK-PI3K信號(hào)通路，從而參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的過程。。

本研究結(jié)果顯示，初治卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中miRNA-3613-3P的表達(dá)水平低于初治卵巢癌原發(fā)灶和卵巢上皮性良性腫瘤。研究表明，在IgA腎病患者的尿沉渣中miRNA-3613-3P低表達(dá)，其高表達(dá)抑制Wnt信號(hào)通路，從而抑制B淋巴細(xì)胞活化，減少免疫球蛋白的分泌[15]。Wnt信號(hào)途徑引起β-catenin積累，β-catenin可調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其異常表達(dá)可引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在卵巢癌細(xì)胞株中miRNA-939高表達(dá)，上調(diào)了Cyclin D1，MY和ECF，激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而使卵巢癌細(xì)胞以懸浮增長的形式進(jìn)行細(xì)胞增殖[16]。在卵巢癌SKOV3細(xì)胞株中miRNA-92a高表達(dá)，其抑制Wnt拮抗劑DKK1，增加STAT3，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞球體形成，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與耐藥[17]。因此，miRNA-3613-3P可能通過抑制Wnt信號(hào)通路，減緩了卵巢癌細(xì)胞球體形成，減少了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；而初治卵巢癌原發(fā)灶中miRNA-3613-3P的表達(dá)水平與卵巢上皮性良性腫瘤比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，猜測其可能在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中作用不大。

復(fù)發(fā)卵巢癌中miRNA-3613-3P的表達(dá)水平低于初治卵巢癌原發(fā)灶。腫瘤干細(xì)胞有高致癌潛能，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展，耐藥及復(fù)發(fā)過程中起重要作用[18]。在卵巢癌的組織細(xì)胞中，miRNA-1207均高表達(dá)，其抑制SFRP1、AXIN2和ICAT，增加β-catenin，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)卵巢癌球體形成，促使卵巢癌細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化[19]。由此推測，miRNA-3613-3P可能參與卵巢癌細(xì)胞向卵巢癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而參與卵巢癌的復(fù)發(fā)。

腫瘤干細(xì)胞在常規(guī)化療后可存活，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，且耐藥性越強(qiáng)侵襲能力越強(qiáng)[20]。在耐卡鉑卵巢癌細(xì)胞株A2780/CP20中Rad6高表達(dá)，其可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞向干細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞耐藥和復(fù)發(fā)[21]。在卵巢癌細(xì)胞株A2780S和OV8中，miRNA-214通過抑制p53，正性調(diào)節(jié)Nanog，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞向干細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)耐藥和復(fù)發(fā)[22]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)卵巢癌中miRNA-3198的表達(dá)水平高于初治卵巢癌轉(zhuǎn)移灶，推測miRNA-3198可能通過參與卵巢癌細(xì)胞向干細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化及耐藥，從而參與卵巢癌的復(fù)發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)研究了初治卵巢癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶、復(fù)發(fā)卵巢癌和卵巢上皮性良性腫瘤組織中miRNA-3198、miRNA-7515、miRNA-8084和miRNA-3613-3P的表達(dá)，后期還需采用生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA的靶基因，探討miRNA及其靶基因的作用機(jī)制，最終在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證miRNA的生物學(xué)功能。