史 春，葛 菲，溫云花

宮頸癌為女性常見的生殖道惡性腫瘤，早期無特異性體征及癥狀，多表現(xiàn)為陰道排液及出血，病死率較高[1]。隨著宮頸癌篩查技術(shù)的進展，其發(fā)病率和病死率逐漸降低，盡早診治是改善患者生存質(zhì)量及預(yù)后的關(guān)鍵[2]。多因素導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生，既往研究證實[3]，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生具有相關(guān)性，以HPV16型最常見，其可導(dǎo)致正常細胞化生，刺激HPV16E6、HPV16E7等致癌基因表達并整合至宿主染色體生成相關(guān)E6、E7蛋白，引起宿主細胞周期調(diào)節(jié)蛋白和癌蛋白互相結(jié)合，導(dǎo)致細胞周期的控制發(fā)生異常產(chǎn)生癌變，但其致癌機制仍未完全明確[4-5]。雖然目前國內(nèi)外關(guān)于HPV16E6及HPV16E7蛋白表達強度的相關(guān)研究較多，但意見尚未達成一致[6]。本研究旨在探討HPV16E6、HPV16E7蛋白在宮頸癌中的表達及意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取?？谑袐D幼保健院2016年1月—2017年10月收治的宮頸癌65例為A組。納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：均經(jīng)病理組織活檢證實為宮頸癌；病歷資料完整；無全子宮切除史；無自身免疫性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：新輔助放化療；全身系統(tǒng)明顯病變；近期伴陰道和宮頸手術(shù)治療史。年齡34～70(44.20±8.65)歲。同期確診的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)80例為B組，年齡31～71(43.10±9.41)歲。同期因子宮頸肌瘤行全子宮切除的正常宮頸患者35例為C組，年齡29～71(45.02±7.54)歲。3組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集：手術(shù)收集相關(guān)病理組織，放置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃低溫箱中待用。

1.2.2HPV16E6及HPV16E7蛋白測定：選用免疫組化染色法(SP)進行，將標(biāo)本組織制作為蠟塊并切片，脫蠟至水。于室溫下予以3%過氧化氫溶液浸泡15 min，采用蒸餾水沖洗，并予以PBS浸泡3次。將切片進行熱抗原修復(fù)，給予PBS液沖洗3次，并滴加5% BSA以封閉，于室溫環(huán)境下孵育20 min，并加入對應(yīng)的一抗工作液，于4℃冰箱中放置過夜。次日取出標(biāo)本，于室溫環(huán)境下放置0.5 h，予以PBS液沖洗3次，并加入生物素以標(biāo)記二抗工作液，于37℃環(huán)境下孵育0.5 h。予以PBS沖洗3次，加入鏈霉親和素復(fù)合體，于37℃環(huán)境中孵育20 min ，并取PBS沖洗3次。再滴加DAB染色，并予以蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精脫水、透明并封片，于顯微鏡下查看染色情況，并控制反應(yīng)時間，以終止反應(yīng)。取自來水沖洗，予以復(fù)染、脫水、透明并封片。以PBS代替一抗為空白對照，作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在光學(xué)顯微鏡持續(xù)觀察10個高倍視野，計算細胞核或者細胞質(zhì)呈棕黃色陽性細胞，陽性細胞數(shù)>10%判定為陽性[8]。

1.2.3臨床病理特征觀察：自行設(shè)計觀察表，核對入組患者年齡、組織類型、組織學(xué)分級、臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤等情況。

2 結(jié)果

2.1HPV16E6及HPV16E7蛋白在正常宮頸、CIN和宮頸癌中表達比較 HPV16E6在正常宮頸中著色位于胞膜，無細胞核染色，在宮頸癌細胞質(zhì)中可見棕黃色陽性細胞；HPV16E7著色位于胞膜，無細胞核染色，其在宮頸癌細胞膜的表達出現(xiàn)減弱或缺失，并且出現(xiàn)細胞質(zhì)表達，且呈棕黃色。A組HPV16E6及HPV16E7蛋白陽性表達率明顯B組和C組(P<0.05)。見圖1、2及表1。

2.2HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系分析 HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和年齡、宮頸癌組織學(xué)分級、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和宮頸癌組織類型、臨床分期及脈管或者宮旁浸潤相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表1 HPV16E6及HPV16E7蛋白在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變和宮頸癌中的表達[例(%)]

注：A組為宮頸癌，B組為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變,C組為正常宮頸；與C組比較；aP<0.05；與B組比較；cP<0.05

2.3宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白表達相關(guān)性分析 宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白呈正相關(guān)(r=0.539，P<0.001)。見表3。

表2 HPV16E6及HPV16E7蛋白表達和宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

表3 宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

宮頸癌發(fā)病機制復(fù)雜，為多分子及多基因水平改變，可引起系列癌基因細胞周期調(diào)控改變及傳導(dǎo)通路異常。臨床研究表明，HPV感染為宮頸癌致病的主要誘因，其作為一種雙鏈DNA病毒，在CIN及宮頸癌發(fā)生中起到重要作用[9-10]。近年來，隨著下生殖道疾病和HPV感染研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)HPV16為HPV高危型的主要類型[11]。HPV16嗜組織性及種屬特異性明顯，可危及黏膜及皮膚鱗狀上皮，其中HPV16E6及HPV16E7蛋白能和多種分子蛋白相互作用，導(dǎo)致細胞發(fā)生無限增殖與惡性轉(zhuǎn)變，共同起到致癌作用[12]。

HPV16E6蛋白作為一種多功能蛋白，其鋅指結(jié)果和惡性轉(zhuǎn)化有著緊密聯(lián)系，P53作為一種主要抑癌基因，HPV16E6能影響P53對相關(guān)信號的轉(zhuǎn)錄，促進P53降解，導(dǎo)致P53抑制細胞生長增殖作用減弱甚至消失，引起癌變[13]。HPV16E6可刺激血管內(nèi)皮生長因子表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，同時能增加外源性DNA整合與誘變[14]。研究證實[15]，宮頸癌及宮頸異型增生與端粒酶激活相關(guān)，HPV16E6能引起高端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNA水平上升，刺激端粒酶表達，導(dǎo)致正常細胞永生化，為CIN轉(zhuǎn)化至宮頸癌的關(guān)鍵步驟，其陽性表達率可隨宮頸癌的不斷進展而相應(yīng)增加。HPV16E7蛋白多位于宿主細胞核內(nèi)分布，也具有鋅指結(jié)構(gòu)，其22～226位氨基酸為pRb蛋白結(jié)合位點，若pRb位點異常能夠影響細胞周期相關(guān)調(diào)控[16]。機體感染HPV16后能夠引起非磷酸化pRb蛋白與HPV16E7結(jié)合，調(diào)節(jié)G1期與S期基因轉(zhuǎn)錄。李玲等[17]研究表明，HPV16感染后的HPV16E6及 HPV16E7蛋白一起參與惡性腫瘤發(fā)生，其中HPV16E6能提高HPV16E7蛋白的致癌能力，二者共同表達容易進展至惡性腫瘤。近期研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，HPV16E6及HPV16E7可能為宮頸癌發(fā)病的獨立危險因素。本研究顯示，宮頸癌組織中HPV16E6及HPV16E7蛋白陽性表達率明顯高于CIN及正常組織，說明二者表達上調(diào)導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要誘因，證實HPV感染和宮頸癌發(fā)生有著良好相關(guān)性，進一步支持研究結(jié)果。

研究報道[20]，與HPV16感染相關(guān)的惡性腫瘤及鱗狀上皮內(nèi)病變中HPV16E6及 HPV16E7蛋白表達明顯上調(diào)，說明其水平改變和細胞惡性轉(zhuǎn)化及病變進展有良好相關(guān)性。本研究進一步分析HPV16E6及HPV16E7蛋白表達和臨床病理聯(lián)系可見，HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和組織類型、臨床分期、脈管或者宮旁浸潤相關(guān)，說明其可一定程度的反映宮頸癌組織類型及浸潤情況，預(yù)測腫瘤惡性程度，可能和HPV16能夠誘導(dǎo)癌旁組織淋巴管及新生血管形成，從而促進腫瘤侵襲，增加惡性程度有關(guān)，但本研究未發(fā)現(xiàn)HPV16E6及HPV16E7蛋白的陽性表達和年齡、宮頸癌組織學(xué)分級、腫瘤直徑等相關(guān)性，可能為本研究樣本數(shù)較少，存在一定的抽樣誤差，有待更多累計實驗考察。同時本結(jié)果顯示，宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白呈正相關(guān)，證實二者之間有著良好的相關(guān)性，共同參與宮頸癌的病變。

綜上所述，HPV16E6和HPV16E7蛋白在宮頸癌組織中呈高表達，且和病理特征有著良好相關(guān)性，其表達可能具有預(yù)測宮頸癌進展價值，可作為判斷宮頸癌的可靠分子生物學(xué)指標(biāo)。