徐德峰，馬忠華*，趙謀明*，張 婷，蘇國萬，趙子健，聶奇倩

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640；3.無限極（中國）有限公司技術中心，廣東 廣州 510665）

皮膚老化所造成的以皺紋為典型代表的各種損美性表現(xiàn)是當今皮膚科學的研究熱點，皮膚老化與抗衰老是當今皮膚科學的研究熱點，紫外線（ultraviolet，UV）輻射引起的皮膚光老化是皮膚外源性衰老的主要原因[1-3]。光老化導致皮膚過早出現(xiàn)表面粗糙、彈性下降、黑色素沉積等損美性癥狀，嚴重影響人們的外表自信心。隨著社會進步和審美標準的不斷提高，人們對皮膚光老化的防治越來越重視。彈性下降是皮膚老化的重要指標，彈性評估是護膚品抗皺功效評價的重要方面。目前，國內外化妝品市場上抗皺產(chǎn)品種類繁多，但總體來看大多以動植物天然提取物為功效因子[4-6]，在使用方法上主要以局部外用為主，功效成分經(jīng)皮吸收后發(fā)揮抗皺作用[5]。鑒于皮膚組織致密的“磚墻結構”，只有小于3 000 Da的分子才能透皮吸收，另外功效成分大多在化學結構上穩(wěn)定性較差，長時間暴露于紫外線等環(huán)境下極易分解，失去本身應有的抗衰功能甚至產(chǎn)生有毒物質[4,7-10]。因此，通過內在途徑修復老化細胞彈性結構，調整胞外基質組成，已是新一代功能性化妝品產(chǎn)品開發(fā)的必然趨勢。

口服VC、VE、黃酮、多糖、肽類物質可改善皮膚皺紋，減輕或修復光老化皮膚損傷[7-9]。自Mellander 1950年首次揭示食源性肽具有生物活性以來，食源性生物活性肽的生物功能就一直引起科學家的興趣和關注[10]。作為蛋白質特定片段，生物活性肽的多種生物功能已被報道，其中改善人和動物皮膚老化的一些活性肽也有報道[11-14]。Chen等[11]通過生物酶解技術制備了鱈魚皮膠原蛋白肽，并通過小鼠口服實驗評價了平均分子質量在1 200 Da的膠原蛋白肽對光老化小鼠皮膚的修復效果，證明該肽可顯著抑制MMPs的表達，降低絲裂原活化蛋白（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平，通過抑制MMPs的表達和活性而顯著改善光誘導的皮膚老化。此外，在人體抗衰老性能評價方面，Proksch等[12]對114 名年齡45～65 歲女性隨機接受2.5 g膠原蛋白肽或相應安慰劑連續(xù)8 周口服暴露，通過雙盲實驗評價了膠原蛋白特定生物活性肽VERISOL(R)在控制眼瞼部位皮膚皺紋形成，刺激前膠原蛋白、彈性蛋白、原纖蛋白生物合成方面的作用，證實口服特定生物活性肽BCP可減少皮膚皺紋，并對真皮基質合成有良好促進效果?；谑吃葱曰钚噪脑诟纳破つw光老化方面的良好應用前景，本研究對4 種食源性活性肽進行口服暴露，評價各自改善光老化皮膚彈性的效果，并基于皮膚彈性的物質基礎和力學結構比較分析各種食源性活性肽的作用機制，為篩選具有顯著改善皮膚光老化效應的活性肽及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雌性SPF級SD大鼠168 只，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，體質量180～200 g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0034，質量合格證號：No.44005800002875。新鮮基礎鼠糧及清潔刨花墊料購自廣州市花都區(qū)實驗動物養(yǎng)殖場。

食源性肽樣品1：狹鱈皮膚膠原蛋白肽 廣州維晟生物科技有限公司；樣品2：彈性蛋白肽 無限極（中國）有限公司技術中心；樣品3：鰹魚動脈球彈性蛋白肽 日本Hayashikane Sangyo公司；核桃肽由華南理工大學趙謀明教授惠贈。

硫化鈉 濟寧宏明化學試劑有限公司；I型膠原蛋白（collagen I，Col I）、III型膠原蛋白（Col III）、羥脯氨酸、透明質酸、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒 南京建成生物公司。

1.2 儀器與設備

紫外光輻照箱為本實驗室自行設計安裝，已獲專利授權[15]；紫外線燈管（UVA 340-40WT12-G13，波長范圍320～400 nm，波峰340 nm；UVB 313-40WT12-G13，波長范圍300～320 nm，波峰313 nm） 荷蘭Philips公司；UV-A型、UVB297型紫外輻照計 北京師范大學光電儀器廠；1510全波長酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；BS-110S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；5424R臺式微量高速離心機 德國Eppendorf公司；cx31倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；7002超低溫冰箱美國Thermo公司；wi79674型斬鼠器 東西儀（北京）科技有限公司；大鼠實驗籠 蘇州市蘇杭科技器材有限公司；FC1502皮膚分析儀 深圳凱爾電子廠。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立

SD大鼠飼養(yǎng)在專用鼠籠中，環(huán)境設施符合實驗動物清潔級要求，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，自然晝夜交替。動物實驗遵守實驗動物倫理學要求，大鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)一周，隨機分為空白組，模型組，樣品1、2、3及核桃肽低、中、高劑量攝食組，共14 組，每組12 只，各組大鼠分2 籠飼養(yǎng)，每籠6 只，空白組與模型組以清潔自來水為唯一飲用水，樣品低、中、高劑量飼喂組在清潔自來水中分別加入終質量濃度0.3、0.6、0.9 g/L的樣品1、2、3及核桃肽，飼料為基礎飼料，自由攝食。適應性飼養(yǎng)1 周后開始輻照，適應性飼養(yǎng)1 周后開始輻照，空白組不進行輻照外其余各組進行等量輻照。參照文獻[16-17]，用記號筆畫出背部脊柱兩側約5.0 cm×5.0 cm區(qū)域并用電推剪剃除毛發(fā)，每次輻照前剃毛并進行Na2S化學脫毛，將脫毛后大鼠放入自制固定器中暴露背部剃毛皮膚，然后連同固定器和大鼠置于紫外線光源（UVA+UVB）正下方40 cm處進行紫外輻照，紫外輻照計測得該處UVA強度為177.9 mW/cm2，UVB強度為59.6 mW/cm2。起始量為10 min/d，隔天1 次，每1 周遞增10 min至30 min/d，并以30 min/d 維持18周至皮膚外觀呈典型老化狀態(tài)表示造模結束，累計照射劑量為UVA 150.88 J/cm2，UVB 78.67 J/cm2，紫外輻照結束后將各組大鼠進行觀察拍照。

1.3.2 指標檢測

1.3.2.1 彈性測定

采用FC1502皮膚分析儀按照說明書進行測定。1.3.2.2 ECM含量檢測

參照文獻[18]，取脫毛后背部中央皮膚組織1 g左右，在預冷的生理鹽水中漂洗，去除皮下脂肪和結締組織，濾紙拭干稱質量，量取9 倍質量預冷生理鹽水，將組織充分剪碎后在組織勻漿機冰浴下制成10%皮膚勻漿。生化法測定皮膚組織勻漿中羥脯氨酸、透明質酸含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒測定膠原蛋白含量及MMP-1活力，具體按照試劑盒說明書進行測定。

1.3.2.3 皮膚組織結構分析

參照文獻[19-20]，取脫毛后背部中央皮膚組織1 g左右，在預冷的生理鹽水中漂洗，去除皮下脂肪和結締組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋后常規(guī)切片與HE染色觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 4 種食源性活性肽對SD大鼠皮膚彈性的影響

皮膚彈性反映了皮膚的力學性能，皮膚彈性與皺紋量呈負相關，而皺紋量又與皮膚老化程度呈正相關，因此皮膚彈性也可間接反映皮膚的衰老狀態(tài)，光老化對皮膚彈性的影響及4 種食源性活性肽對光老化皮膚彈性的提升效果見圖1。與空白對照組相比，模型組大鼠皮膚彈性顯著降低，表明皮膚呈嚴重衰老狀態(tài)，而4 種食源性活性肽干預組大鼠皮膚彈性得到不同程度提升，在低劑量時彈性開始改善，中、高劑量時達到顯著性水平（P＜0.05），表明肽對皮膚光老化有不同程度的修復作用，不同活性肽改善光老化皮膚彈性有明顯差異，其中以樣品2最為顯著，樣品1和核桃肽其次，樣品3效果相對較差。

圖 1 4 種食源性肽對SD大鼠皮膚彈性的影響Fig. 1 Effects of four kinds of food-derived peptides on the elasticity of UV-exposed skin of SD rats

2.2 4 種食源性肽對胞外主要基質成分含量的影響

細胞外基質成分與皮膚力學性能密切相關，良好的胞外基質成分構成與排列是維持皮膚良好彈性的物質基礎。皮膚蛋白中75%由膠原蛋白組成，膠原蛋白維持著皮膚的彈性和水潤狀態(tài)[21]，皮膚中膠原蛋白的含量是皮膚衰老的重要指標。皮膚中膠原蛋白有多種類型，其中與彈性相關的主要為Col I和Col III，在皮膚衰老進程中，Col I含量下降而Col III含量上升，調整二者比例則在一定程度上起到抗衰老效果[22]。由圖2a、b可以看出，與空白對照組相比，模型組大鼠皮膚組織中Col I含量顯著下降而Col III含量極顯著上升（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，4 種食源性活性肽干預后可不同程度調整膠原蛋白類型和含量，尤其是Col I含量差異顯著，低劑量時Col I輕微升高，中、高劑量時不同活性肽增加Col I含量差異較大，樣品2和核桃肽均可顯著提升Col I含量，而樣品1和3效果相對較弱。在降低Col III含量方面，雖然不同肽在整體上都呈劑量-效應趨勢，但降低幅度均未達到顯著性水平，綜合比較以樣品2效果最好。Hinek等[22]采用蛋白激酶K對牛頸部蛋白進行酶解，制備分子質量在10 kDa以下的蛋白酶解物，命名為Prok-60，并在細胞和動物水平上證實Prok-60肽類物質可顯著促進真皮成纖維細胞胞外基質Col I膠原蛋白和彈性蛋白的生物合成，從而增強皮膚彈性對抗皮膚衰老，與本研究結果較為一致。

圖 2 4 種食源性肽對SD大鼠皮膚ECM主要成分的影響Fig. 2 Effects of four kinds of food-derived peptides on major components of extracellular matrix in UV-exposed skin of SD rats

羥脯氨酸是膠原蛋白特有的一種非必需氨基酸，其含量相對恒定，約占膠原蛋白總量的13%，直接反應真皮內膠原纖維的含量變化，從而能夠作為判定皮膚衰老程度的一個敏感指標[23]。由圖2c可以看出，與空白組相比，模型組大鼠皮膚組織羥脯氨酸含量顯著減少，達到極顯著水平（P＜0.01），4 種肽口服干預后羥脯氨酸含量呈量-效提高，其中以樣品2和核桃肽提升效果優(yōu)于樣品1和樣品3，在中、高劑量時提升效果均達到顯著性水平（P＜0.05）。多項研究表明，透明質酸不僅對保持皮膚水分、維持皮膚結構起重要作用，而且具有促進皮膚再生、增強皮膚彈性、降解皮膚中自由基的功能[24-25]。本研究證實，與空白組相比，模型組大鼠皮膚組織透明質酸含量顯著降低（P＜0.01），而4 種活性肽可在不同程度上提升透明質酸含量，提高皮膚彈性，在中、高劑量時所有樣品均可顯著提升透明質酸含量（P＜0.05），但以樣品2效果最為突出。

2.3 4 種食源性肽對MMP-1含量的影響

MMPs的產(chǎn)生影響膠原纖維合成，使得真皮層內膠原纖維明顯減少，排列稀疏紊亂。MMP-1是膠原蛋白降解酶，可將大分子膠原蛋白降解成片段化，然后片段化膠原蛋白進一步濃縮聚集，失去彈性結構，MMP-1活力高低與皮膚衰老狀態(tài)呈正相關[26-29]。表皮是MMP-1的主要來源，在急性UV輻照下MMP-1快速產(chǎn)生，之后遷移至真皮層降解膠原纖維，MMP-1含量升高是介導膠原纖維結構劣變的關鍵步驟[30]，UVA+UVB聯(lián)合輻照對SD大鼠皮膚組織MMP-1表達的影響及活性肽干預效應見圖3。

圖 3 4 種食源性肽對SD大鼠皮膚MMP-1活力的影響Fig. 3 Effects of four kinds of food-derived peptides on MMP-1 activity in UV-exposed skin of SD rats

由圖3可以看出，模型組MMP-1活力顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明光刺激激活了MMP-1表達，4 種食源性肽口服干預后MMP-1活力呈劑量-效應趨勢下調，表明所選活性肽抑制了MMP-1表達，且不同活性肽抑制能力存在顯著差異，樣品2在中劑量時可顯著抑制MMP-1活力（P＜0.05），而核桃肽和樣品1要在高劑量時才能達到顯著性水平，因此樣品2修復光老化效果更好。

2.4 對皮膚力學結構的影響

組織病理學改變是皮膚光老化的重要評價指標之一，彈性良好的皮膚其表皮和真皮層物理屏障結構均維持平衡狀態(tài)。在皮膚光老化過程中，長期紫外線照射可損傷表皮角質形成細胞，造成表皮細胞分化紊亂，細胞更替和角質剝脫延緩，引起結構紊亂，表皮反應性增生[31-32]，表現(xiàn)為表皮增厚、真皮層變薄、基底膜變平、結構不清晰，真皮組織內纖維性成分變性扭曲。皮膚組織病理學實驗可進一步解釋皮膚光老化進程中的組織學特征及食源性活性肽的干預效應，將抗衰效果最明顯的樣品2進行組織切片和HE染色觀察，結果見圖4。

圖 4 食源性樣品2對SD大鼠皮膚組織結構的影響（200×）Fig. 4 Effect of elastin-derived peptide 2 on the microstructure of skin in SD rats (200 ×)

由圖4可以看出，空白組皮膚細膩、平坦少皺紋，表皮正常、結構完整，真皮膠原纖維呈波浪狀排列，整齊有序，分布均勻，血管正常，細胞成分及數(shù)量適中。與空白組相比，模型組皮膚有明顯紅斑反應，較多深大橫向皺紋，表皮不規(guī)則增厚，真皮膠原纖維變性、排列紊亂、卷曲、斷裂、疏密分布不均、附屬器增生。與模型組相比，樣品2干預后除了宏觀皺紋顯著減少外，其微觀結構中表皮增生也得到顯著抑制，且效果與肽質量濃度呈一定的劑量反應性。Chen等[9]在為期3 個月的實驗周期內，將EGb-761肽于UVB輻照前1 h以2 mg/mL涂抹于BALB/c小鼠背部，可顯著減少表面粗大皺紋量，HE染色證實在組織化學水平上可降低表皮增生，降低光老化損傷，證明肽可通過改善光老化皮膚組織結構而發(fā)揮抗衰老作用，其實驗結果與本研究相近。

3 討 論

光老化是當今皮膚科學基礎研究和技術開發(fā)的熱點[1-3]，彈性及皺紋狀況是衰老評價的重要指標，基于提升彈性從而改善皺紋是目前皮膚抗衰老產(chǎn)品開發(fā)的基本思路。鑒于皮膚組織致密的致密性，以及功效成分在結構上穩(wěn)定性較差，內在途徑修復老化細胞彈性結構，調整胞外基質組成，已是新一代功能性化妝品產(chǎn)品開發(fā)的必然趨勢[32]。已有的多項研究表明口服抗氧化天然成分、多糖或肽類物質可減輕光老化所致皮膚皺紋[5,7-8,11-12]，本研究基于已有的衰老理論和活性肽研究開發(fā)技術進展，在初步篩選幾種食源性活性肽的基礎上，通過復制皮膚光老化動物模型，考察各自對光老化皮膚彈性的提升效果，證明樣品2在中、高劑量時可顯著提升皮膚彈性，具有良好的抗衰功效，是保健食品開發(fā)的首先基料。

皮膚彈性等力學性能與ECM成分和排列結構密切相關。在ECM成分中，膠原纖維、羥脯氨酸和透明質酸的質量狀況直接影響皮膚的老化程度，膠原纖維結構的改變及膠原蛋白含量的減少是導致皮膚衰老的重要原因，真皮層膠原纖維是皮膚組織的主要結構蛋白，膠原纖維的片段化是人類皮膚衰老的主要特征[23,29]。羥脯氨酸是膠原蛋白特有的一種非必需氨基酸，其含量相對恒定，約占膠原蛋白總量的13%，可直接反應真皮內膠原纖維的含量變化，從而能夠作為判定皮膚衰老程度的一個敏感指標。透明質酸不僅對保持皮膚水分、維持皮膚結構起重要作用，而且具有促進皮膚再生、增強皮膚彈性、降解皮膚中自由基的功能[26-27]。因此，促進ECM主要成分膠原纖維、羥脯氨酸和透明質酸的生物合成，抑制ECM結構性降解是維持皮膚彈性的重要途徑。本研究發(fā)現(xiàn)紫外線輻射后皮膚表皮層增生明顯，真皮層厚度顯著降低，羥脯氨酸和透明質酸含量顯著減少，且MMP-1表達增強，提示紫外線輻射導致皮膚膠原蛋白分解增多，使皮膚膠原蛋白含量減少，真皮層變薄。4 種活性肽口服干預后，可見ECM成分發(fā)生響應式表達上調，且膠原纖維片段化聚集得到明顯抑制，重現(xiàn)波浪形橫紋帶，表明光老化受損結構得到不同程度的修復而功能得到相應恢復。

本研究通過組織學和皮膚生化指標的測定，說明口服一定劑量的活性肽能增加光老化大鼠皮膚膠原的厚度，使膠原纖維的排列更為致密，提高皮膚彈性，增加膠原蛋白的含量，初步證實了活性肽可能是通過刺激皮膚膠原蛋白的合成，并減少降解，以達到抗皮膚光老化的作用。因此，基于本實驗結果可概括出光誘導皮膚皺紋形成的物質與結構基礎及活性肽樣品2抗皺機制，具體見圖5。

圖 5 光誘導皮膚皺紋形成的物質與結構基礎（a）及活性肽樣品2抗皺機制（b）Fig. 5 Framework of skin photoaging process mediated by oxidation and immunity stress (a) and its prevention mechanism by food-derived biopeptides (b)

4 結 論

口服攝入一定種類和劑量的食源性肽可提高光老化皮膚彈性，其原因在于增加Col I、羥脯氨酸和透明質酸含量，降低Col III含量和MMP-1活力，修復ECM結構損傷，恢復細胞彈性的物質基礎，其中樣品2總體效果最好，可明顯抑制表皮增生，促進真皮層膠原纖維合成，修復受損細胞活力，是開發(fā)抗衰食品的首選原料。