王 卓，周丹丹，彭 菁，屠 康*，馬佩沛

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

藍莓為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）植物的果實，其營養(yǎng)豐富，風味獨特，富含多酚，尤其是花青素，具有強抗氧化活性。研究表明，藍莓具有多種保健功效，如抗氧化、抗糖尿病、抗惡性細胞增生、護肝、抗炎癥、預防癌癥、保護心臟等功效[1]。近年來藍莓的種植和消費都呈快速增長趨勢，已成為世界上消費量僅次于草莓的第二大漿果。然而由于失水作用和微生物侵染，藍莓鮮果極易腐爛，貨架期短[2]。

軟化是限制藍莓貨架期的主要因素。藍莓采后軟化會影響果實的品質(zhì)、貨架期、可運輸性和抗病性[3]。微生物侵染是導致藍莓采后腐敗、快速軟化的因素之一[4-5]。藍莓表面附著著大量的酵母、霉菌及潛在的致腐微生物，如：鏈格孢菌（Alternaria spp. ）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、炭疽菌（Colletotrichum spp.）。此外，藍莓表面的大腸桿菌等病原菌也會對消費者的健康造成威脅[6]。

近年來，低溫等離子體技術(shù)作為一種新興的冷殺菌技術(shù)應用于食品殺菌領域，受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注[7-9]。研究表明，低溫等離子體能有效地殺死或鈍化細菌、霉菌、酵母及其他有害的微生物，甚至使孢子和生物菌膜失活[10]。在高壓電場條件下，介質(zhì)氣體處于高度電離狀態(tài)，即等離子體，其中含有的多種活性基團和粒子（臭氧、自由電子、自由基、活性氧、NOx、UV光）能破壞細胞結(jié)構(gòu)，破壞微生物的細胞膜和蛋白質(zhì)，最終導致微生物死亡[11]。與傳統(tǒng)化學殺菌方法相比，低溫等離子體殺菌時間短、殺菌效果好，且無化學試劑殘留，在果蔬殺菌上有著廣闊的應用前景[12-14]。Baier等[15]利用氬氣等離子體射流處理野苣、黃瓜、蘋果和櫻桃番茄，發(fā)現(xiàn)等離子體處理30 s能有效降低果蔬表面的大腸桿菌。Misra等[16]發(fā)現(xiàn)60 kV下低溫等離子體處理5 min能減少番茄櫻桃上的微生物菌落數(shù)量。然而，目前的研究多關(guān)注低溫等離子體的殺菌效果，對處理后產(chǎn)品貯藏期品質(zhì)的影響研究較少。

本研究利用介質(zhì)阻擋放電等離子體設備對藍莓鮮果進行殺菌處理，探討低溫等離子體對藍莓表面的殺菌效果及其常溫貯藏期間品質(zhì)的影響，并對藍莓總抗氧化能力和抗氧化酶活力進行了研究，為低溫等離子體應用于藍莓殺菌保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試藍莓品種為‘燦爛’（Vaccinium ashei cv.Brilliant），2016年7月28日手工采摘于江蘇省南京市白馬鎮(zhèn)藍莓種植基地。果實在商業(yè)成熟時采收，并在2 h內(nèi)運送至實驗室。挑選大小、顏色基本一致，無機械損傷和腐爛的藍莓果實，置于4 ℃、相對濕度80%～90%條件下預冷24 h。

聚丙烯塑料托盤（130 mm×80 mm×15 mm）購于廣東林生公司。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（crosslinking polyvingypyrrolidone，PVPP）、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、愈創(chuàng)木酚（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

介質(zhì)阻擋放電型（dielectric barrier discharge，DBD）低溫等離子體設備 美國Phenix Technologies公司；TA. new plus質(zhì)構(gòu)儀 美國ISENSO公司；PAL-1型便攜式色差計 日本ATAGO公司；UV1800型紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；CTHI-250B恒溫恒濕箱上海施都凱設備公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫等離子體處理

圖 1 DBD低溫等離子體發(fā)生裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of DBD cold plasma generator set-up for blueblerry treatment

圖1為本實驗所用DBD低溫等離子體發(fā)生裝置的示意圖。在兩個放電電極之間的密閉包裝中產(chǎn)生等離子體，主要起殺菌或抑菌作用的是干燥空氣中的臭氧和紫外光。通過預實驗確定了低溫等離子體處理條件，篩選出殺菌效果好且對藍莓果實特征無影響的處理時間和電壓范圍。將果實分裝于塑料托盤中，用塑料薄膜密封，每盒裝120 g（約70 個）藍莓果實。隨機分成2 組，低溫等離子體處理組利用DBD低溫等離子體設備在工作電壓45 kV下處理50 s（工作氣體為溫度20 ℃、相對濕度48%的空氣），對照組不進行低溫等離子體處理。處理后立即檢測藍莓表面微生物數(shù)量，并將樣品置于20 ℃、相對濕度85%的恒溫恒濕箱中貯藏8 d，每隔1 d取樣檢測各項指標，每組3 個重復。

1.3.2 微生物指標的測定

微生物菌落總數(shù)：參考Lacombe等[17]的方法，采用涂布平板計數(shù)法測定。每組取8 個藍莓果實（約14 g）于100 mL錐形瓶中，加入25 mL無菌生理鹽水，用漩渦儀振蕩1 min制成樣品液，設置3 個稀釋度，分別吸取0.1 mL 樣品稀釋液于平板計數(shù)瓊脂 （plate count agar，PCA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，涂布均勻。PCA平板在37 ℃培養(yǎng)24～48 h，PDA平板在28 ℃培養(yǎng)5～7 d，分別用以計數(shù)細菌菌落總數(shù)和酵母霉菌菌落總數(shù)。殺菌處理后立即進行微生物指標檢測，之后每48 h檢測1 次。

1.3.3 藍莓品質(zhì)指標測定

腐爛率采用計數(shù)法測定[18]，果實表面有可見菌絲體生長或汁液外露即為腐爛，腐爛率的計算見公式（1）。

果實硬度采用TA. new plus質(zhì)構(gòu)儀測定，選用柱形探頭TA/2（直徑為2 mm），測試速率為1 mm/s，穿刺深度為5 mm，測定穿刺過程中的最大力即藍莓硬度。每組測10 個果實，每個果實測2 次。

每組取10 個藍莓果實，去皮破碎后用3 層紗布過濾，采用PAL-1型數(shù)顯折光儀測定可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)。

可滴定酸質(zhì)量分數(shù)采用電位滴定法測定[19]。用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.1，以檸檬酸質(zhì)量分數(shù)表示。

VC含量采取鉬酸銨比色法測定[20]。稱取2.0 g樣品果肉，加5 mL草酸-EDTA，冰浴研磨，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液，依次加入3 mL 0.05 mol/L草酸-EDTA、0.5 mL 1 mg/mL偏磷酸-乙酸、1.0 mL體積分數(shù)5%硫酸溶液、2.0 mL質(zhì)量分數(shù)5%鉬酸銨溶液，用蒸餾水定容至20 mL。80 ℃水浴1 h，在760 nm波長處測定吸光度。

總酚含量采用乙醇酸比色法測定[21]。取1.0 g樣品，加少許體積分數(shù)1%鹽酸-乙醇溶液冰浴研磨，定容至50 mL。在40 ℃下超聲提取1 h后進行10 000 r/min離心5 min，取濾液測定其在240 nm波長處的吸光度。以不同質(zhì)量濃度的沒食子酸（2.0～20.0 mg/L）制作標準曲線，樣品總酚含量以每克鮮樣中含有的沒食子酸質(zhì)量表示。

花青素含量采用pH示差法測定[22]。根據(jù)花青素的發(fā)色基團在pH 1.0和pH 4.5間結(jié)構(gòu)的不同，以吸光度之差表示相對花青素含量。利用紫外-可見分光光度計測定pH 1.0和pH 4.5的樣品緩沖液在520 nm和700 nm波長處的吸光度?；ㄇ嗨睾坑嬎阋娛剑?）。

式中：M表示矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，為449.2 g/mol；F表示稀釋倍數(shù)，為10；e表示矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)，為26 900 L/（mol·cm）；L表示比色皿光路長，為1 cm。

總抗氧化能力采用亞鐵還原能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）法測定[23]。稱取0.5 g樣品，加10 mL體積分數(shù)1%鹽酸-乙醇溶液，冰浴研磨，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液備用。取5 μL樣品提取液，加入180 μL FRAP工作液（含150 μL 0.3mol/L醋酸緩沖液（pH 3.6）、15 μL 10 mmol/L 三吡啶基三嗪溶液、15 μL 20 mmol/L FeCl3溶液），混勻，反應6 min，用酶標儀測定593 nm波長處的吸光度。

1.3.4 抗氧化酶活力的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（ascorbate peroxidase，PPO）活力的測定參照《果蔬采后生理生化實驗指導》[19]中的方法并稍作修改。

抗氧化酶液的提?。簻蚀_稱取1.0 g樣品于研缽中，加入3.0 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，冰浴研磨，于4 ℃、12 000×g離心30 min，取上清液備用。

S O D活力采用比色法測定。在試管中依次加入1.7 mL 50 mmol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖液、0.3 mL 130 mmol/L蛋氨酸溶液、0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液、0.3 mL 100 μmol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液、0.3 mL 20 μmol/L核黃素溶液和0.1 mL酶提取液。將對照管置于暗處，其他各管置于4 000 lx日光燈下反應5 min后取出，置于暗處終止反應。以不照光管作空白參比調(diào)零，于560 nm波長處測其他各管吸光度。以每克樣品的反應體系對NBT光化還原抑制50%時所需的酶量為一個SOD活力單位。

CAT活力采用比色法測定。取2.8 mL 20 mmol/L H2O2溶液和200 μL酶提取液。以蒸餾水為參比空白，在反應15 s時開始記錄反應體系在240 nm波長處吸光度。以每克樣品每分鐘吸光度減少0.01為一個CAT活力單位。

POD活力采用愈創(chuàng)木酚法測定。取3.0 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液和0.5 mL酶提取液，再加入20 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合啟動反應，同時開始計時。以蒸餾水為參比，在反應15 s時開始記錄反應體系在470 nm波長處的吸光度。以每克樣品每分鐘吸光度增加0.01為一個POD活力單位。

P P O活力采用比色法測定。在試管中加入2.0 mL 0.1 mol/L pH 6.4磷酸鹽緩沖液和1.0 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液，最后加入0.5 mL酶提取液，同時開始計時。在反應15 s時開始記錄反應體系在420 nm波長處吸光度。以每克樣品每分鐘吸光度變化1為一個PPO活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。采用SPSS 22進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，差異顯著性采用鄧肯多重比較檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫等離子體處理對藍莓的殺菌效果

圖2為等離子體處理組和對照組藍莓在貯藏期間表面微生物菌落總數(shù)的變化。藍莓表面微生物數(shù)量在20 ℃貯藏期間呈上升趨勢，低溫等離子體處理可有效降低藍莓微生物數(shù)量（細菌、霉菌和酵母），且在整個貯藏期間微生物數(shù)量都明顯低于對照組。低溫等離子體處理后立即檢測藍莓表面微生物數(shù)量，發(fā)現(xiàn)細菌、霉菌和酵母菌落總數(shù)分別下降了1.75（lg（CFU/g））和1.77（lg（CFU/g）），貯藏第8天時，細菌、霉菌和酵母菌落總數(shù)分別比對照組低2.01（lg（CFU/g））和2.09（lg（CFU/g）），可見低溫等離子體能夠有效抑制微生物的生長，對藍莓常溫貯藏期間表面微生物數(shù)量具有良好的控制作用。

圖 2 低溫等離子體處理后藍莓在20 ℃貯藏期間表面細菌（A）和酵母、霉菌（B）菌落總數(shù)變化Fig. 2 Effect of CP treatment on total aerobic mesophilic bacteria (A),and yeast/mold (B) counts on blueberries stored at 20 ℃

2.2 低溫等離子體處理對藍莓果實品質(zhì)的影響

2.2.1 腐爛率和硬度

圖 3 低溫等離子體處理后藍莓在20 ℃貯藏期間腐爛率（A）和硬度（B）變化Fig. 3 Effect of CP treatment on decay incidence (A) and firmness (B)of blueberries stored at 20 ℃

藍莓果實在貯藏期間易受微生物侵染而發(fā)生腐爛。腐爛率直接影響藍莓鮮果貨架期的長短。由圖3A可知，藍莓在貯藏期間腐爛率持續(xù)上升。貯藏前2 d，基本沒有腐爛；對照組從第4天開始腐爛率明顯升高，為10.24%；到第8天時，腐爛率達到39.36%。低溫等離子體處理組在貯藏期間，腐爛率明顯低于對照組，在貯藏結(jié)束時腐爛率僅為11.18%?？赡苁且驗榈蜏氐入x子體抑制了微生物的生長，從而降低腐爛率，延長了藍莓鮮果的貨架期。

果實硬度是影響藍莓品質(zhì)的主要因素之一，過度軟化會導致藍莓品質(zhì)下降，降低鮮果的商品價值。如圖3B所示，藍莓在貯藏過程中，果實硬度逐漸下降，在貯藏第8天，果實硬度已下降至1.2 N。經(jīng)低溫等離子體處理的藍莓在貯藏2～4 d硬度增大，且在之后的貯藏過程中能較好地維持果實硬度。從貯藏第4天起，處理組藍莓的硬度顯著高于對照組。低溫等離子體處理可能抑制了藍莓細胞壁水解酶的活力，抑制了果膠、半纖維素、纖維素等物質(zhì)的水解，同時可能促進了木質(zhì)素等的合成，從而抑制了果實硬度的下降。

2.2.2 可溶性固形物和可滴定酸質(zhì)量分數(shù)

圖 4 低溫等離子體處理后藍莓在20 ℃貯藏期間可溶性固形物（A）和可滴定酸（B）質(zhì)量分數(shù)變化Fig. 4 Effect of CP treatment on soluble solid (A) and titratable acidity(B) contents of blueberries stored at 20 ℃

可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)在果實貯藏過程中的變化一方面是由于大分子物質(zhì)的降解；另一方面是作為呼吸的底物被消耗。從圖4A可以看出，對照組的可溶性固形物由于作為果實呼吸底物被消耗，可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)在貯藏前期下降，貯藏后期由于果實軟化而上升。低溫等離子體處理組在貯藏后期可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)低于對照組，可能是由于低溫等離子體延緩了果實軟化，抑制了大分子物質(zhì)的降解。圖4B為藍莓貯藏期間可滴定酸質(zhì)量分數(shù)的變化。對照組的可滴定酸作為呼吸底物之一被消耗，在貯藏前期其質(zhì)量分數(shù)逐漸下降，在第4天降至最低值0.68%，之后可滴定酸質(zhì)量分數(shù)開始上升，可能是腐爛導致的。而低溫等離子體處理組在貯藏后期未引起可滴定酸質(zhì)量分數(shù)的明顯上升，可能是由于低溫等離子體處理抑制了藍莓表面微生物生長，減少了腐爛的發(fā)生。

2.2.3 VC、總酚、花青素含量

圖 5 低溫等離子體處理后藍莓在20 ℃貯藏期間VC（A）、總酚（B）、花青素（C）含量的變化Fig. 5 Effect of CP treatment on VC (A), total phenolics (B) and total anthocyanin (C) contents of blueberries stored at 20 ℃

如圖5A所示，藍莓在20 ℃貯藏期間VC含量呈逐漸下降的趨勢。低溫等離子體處理組在貯藏2～4 d VC含量上升，在第4天比對照組高23.82 mg/100 g。貯藏4 d后，處理組VC含量顯著高于對照組。到貯藏第8 天，處理組VC含量比對照組高11.11 mg/100 g。

藍莓中酚類物質(zhì)主要由類黃酮（主要為花青素）和酚酸組成。如圖5B所示，對照組藍莓在20 ℃貯藏期間，總酚含量呈先上升后下降的趨勢，在貯藏第2天達到最高值。低溫等離子體處理組在貯藏前期總酚含量較對照組低，可能是由于等離子體含有自由基等很多反應活性物質(zhì)，引起了酚類等生物活性物質(zhì)的氧化，但在貯藏后期，總酚含量保持平穩(wěn)，沒有明顯下降。花青素具有強抗氧化作用，主要存在于藍莓果皮中。如圖5C所示，藍莓在貯藏期間花青素含量也呈先上升后下降趨勢。貯藏前期，可能是由于果實中的原花青素分解，從而對照組花青素含量增加。在貯藏2 d后，青素含量開始逐漸下降，可能是衰老引起了花青素的氧化分解。低溫等離子體處理組在貯藏前期組花青素含量有所下降，但貯藏后期花青素含量基本保持穩(wěn)定，未有明顯下降，與對照組相比能更好地保持花青素的含量。

圖 6 低溫等離子體處理后藍莓在20 ℃貯藏期間的總抗氧化能力的變化Fig. 6 Effect of CP treatment on total antioxidant capacity of blueberries stored at 20 ℃

2.2.4 總抗氧化能力藍莓總抗氧化能力主要由類黃酮（花青素為主）、單寧、酚酸、VC等物質(zhì)含量決定。由圖6可以看出，低溫等離子體處理組藍莓總抗氧化能力與對照組相比沒有顯著性差異，且在整個貯藏期間，藍莓總抗氧化能力變化不大。低溫等離子體處理引起了花青素等酚類含量的降低，促進了VC的積累，可能由于這些抗氧化物質(zhì)共同作用，維持了藍莓總抗氧化能力的平衡。由此可以推斷，低溫等離子體處理對藍莓總抗氧化能力沒有顯著影響。

2.3 低溫等離子體處理對藍莓抗氧化酶系活力的影響

圖 7 低溫等離子體處理后藍莓在20 ℃貯藏期間SOD（A）、CAT（B）、POD（C）和PPO（D）活力的變化Fig. 7 Effect of CP treatment on SOD (A), CAT (B), POD (C) and PPO (D) activities in blueberries stored at 20 ℃

SOD、CAT、POD是藍莓體內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，將其快速歧化為H2O2和H2O，從而清除超氧陰離子自由基，產(chǎn)生的H2O2由CAT、POD等酶再分解為H2O和O2，以減少H2O2對果實細胞組織可能造成的氧化傷害。如圖7所示，4 d后，藍莓SOD和CAT活力逐漸下降，POD活力先上升后又下降。從圖7A可以看出，處理組SOD活力在貯藏期間始終高于對照組，在貯藏第2 天，處理組與對照組SOD活力分別為498.16 U/（min·g）和408.10 U/（min·g），可能是低溫等離子體誘導了藍莓SOD活力。從圖7B可以看出，處理組CAT活力先上升后下降，在貯藏第4天時達到最大值13 615 U/（min·g）。圖7C表明，處理組和對照組POD活力在前2 d均上升，第2天時處理組為120.48 U/（min·g），而對照組為97.24 U/（min·g）。由此推斷，等離子體處理可能誘導了藍莓SOD、CAT和POD活力，從而促進體內(nèi)H2O2的清除，減輕了自由基對組織的侵害。

PPO可以催化多種簡單酚類物質(zhì)氧化形成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進一步聚合形成深色的聚合物，同時可以催化木質(zhì)素的合成。從圖7D可以看出，對照組藍莓在貯藏期間PPO活力先下降后上升。而處理組PPO活力呈先上升后下降的趨勢，且在貯藏期間PPO活力顯著高于對照組，這可能是由于低溫等離子體處理誘導了藍莓貯藏初期PPO活力的上升。由此推斷，等離子體處理可能是通過提高藍莓PPO活力，促進花青素的降解和木質(zhì)素的合成，從而引起貯藏前期總酚和花青素含量的下降，抑制了硬度的降低。

3 討 論

目前應用于藍莓的殺菌方法主要為氯水消毒[24]，但其殺菌能力有限，且易造成化學殘留。紫外線、超聲和臭氧等非熱殺菌技術(shù)，通常需要20～60 min才能有效降低病原菌和腐敗微生物數(shù)量[25-28]。本研究結(jié)果表明，利用45 kV電壓下產(chǎn)生的低溫等離子體處理藍莓50 s，能顯著降低藍莓表面微生物數(shù)量，細菌和霉菌酵母分別下降1.75（lg（CFU/g））和1.77（lg（CFU/g）），且在20℃貯藏期間也能較好地抑制微生物的生長，貯藏第8天時，細菌和霉菌酵母數(shù)量分別比對照組低2.01（lg（CFU/g））和2.09（lg（CFU/g））。低溫等離子體處理組在20 ℃貯藏8 d后，腐爛率僅為11.18%，而對照組腐爛率達到39.36%，可見低溫等離子體能夠有效抑制藍莓表面微生物的生長，減少腐爛的發(fā)生。這與Lacombe等[17]利用低溫等離子體射流處理藍莓并在4 ℃貯藏條件下的研究結(jié)果一致。由于低溫等離子體含有多種活性物質(zhì)，可能產(chǎn)生了協(xié)同殺菌作用，因而比單一的紫外或電子輻照等殺菌方法更快速高效。

然而，低溫等離子體中的帶電粒子和反應活性物質(zhì)可能會對果蔬物理化學性質(zhì)和營養(yǎng)成分產(chǎn)生不利影響。等離子體可能引起酚類、花青素等的氧化，從而降低其抗氧化能力，但是在一定范圍內(nèi)，輕微的氧化是可以被接受的[29]。也有研究表明，由于采后酚類物質(zhì)的代謝，藍莓貯藏期間抗氧化能力無顯著變化[30-31]。本實驗對低溫等離子體處理后的藍莓在20 ℃貯藏期間的品質(zhì)進行了初步評價，研究結(jié)果顯示，低溫等離子體處理抑制了藍莓的硬度和VC含量的下降，花青素和總酚含量在貯藏初期略有下降，但對總抗氧化能力無顯著影響。與對照組相比，低溫等離子體處理可提高藍莓抗氧化酶SOD、CAT、POD的活力，促進超氧陰離子自由基的清除，同時可提高PPO活力，促進藍莓酚類氧化形成醌類，催化木質(zhì)素合成。

綜上，低溫等離子體對藍莓表面的微生物具有良好的抑制作用，能提高藍莓常溫貯藏期間的品質(zhì)，能夠作為一種冷殺菌方法應用于藍莓殺菌保鮮中。目前低溫等離子體技術(shù)在食品方面的應用研究仍處于初級階段，其殺菌機理還有待進一步研究。