蘇 平，孫 昕，宋思圓*，魏 丹

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus（L.）Moench）是原產(chǎn)于非洲的錦葵科熱帶植物，其花中富含多糖、蛋白質(zhì)、黃酮、脂肪酸、礦物質(zhì)元素等物質(zhì)，營養(yǎng)保健價(jià)值高，具有很大的開發(fā)潛力[1-2]。黃劍波等[3]以成熟的黃秋葵為原料，研究了硫酸鋁沉淀法提取果膠的工藝方法，黃秋葵的果膠提取率達(dá)到25.96%，證明黃秋葵是一種果膠含量高的植物資源，因此可將其作為一種優(yōu)質(zhì)的多糖資源。

多糖的提取有熱水提取法、酸提法、酶提法、超聲提取法等[4-5]。黃秋葵葉水提多糖存在α-糖苷鍵構(gòu)型，原子力顯微鏡觀察結(jié)果表明多糖分子間相互纏繞，呈規(guī)則團(tuán)聚狀，經(jīng)進(jìn)一步的抗氧化性實(shí)驗(yàn)研究可知，黃秋葵葉粗多糖對(duì)自由基有一定的清除作用[6]。劉曉霞[7]采用酸法提取黃秋葵花中的果膠類多糖，并研究了其理化性質(zhì)、流變特性和結(jié)構(gòu)等，發(fā)現(xiàn)黃秋葵花果膠類多糖是一種主要由半乳糖、鼠李糖以及半乳糖醛酸組成的酸性雜多糖。宋思圓等[8]研究超聲輔助提取黃秋葵花果膠多糖的抗氧化活性，結(jié)果表明經(jīng)超聲輔助提取得到的黃秋葵花果膠多糖有較好的體外抗氧化活性，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力為（91.31±1.05）mg Trolox/g，2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基清除能力為（50.05±2.50）mg Trolox/g，鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）為（65.96±0.14）mg Trolox/g以及氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）為（25.74±1.29）mg Trolox/g。有研究表明提取方法會(huì)顯著影響多糖的提取率、結(jié)構(gòu)特征以及生物活性[1]。但目前不同提取方法與黃秋葵花多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性之間的關(guān)系鮮有報(bào)道[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)比較了熱水、酸法、酶法、超聲輔助提取法對(duì)黃秋葵花多糖提取效果的影響，并對(duì)所提多糖的結(jié)構(gòu)組成和抗氧化能力進(jìn)行了研究，以期為黃秋葵多糖的綜合開發(fā)利用提供技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵花產(chǎn)自浙江嘉善，品種為纖指黃秋葵花，60 ℃烘干，粉碎后過60 目篩備用；氯化鈉、三氟乙酸、鹽酸、檸檬酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP）、纖維素酶（15 000 U/g）、甲醇、VC、過硫酸鉀、95%乙醇均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、水溶性維生素E（Trolox）均為分析純、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）、ABTS、熒光素鈉均為分析純 上海阿拉丁試劑有限公司；DEAE-Q Sepharose Fast Flow纖維素填料 英國Watman公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DC-0506低溫恒溫槽 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；PH070A恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；JA1003N電子天平 上海菁海儀器有限公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；DAWN HELEOS Ⅱ多角度激光散射檢測器 美國Wyatt公司；1836-A烏氏黏度計(jì) 浙江臺(tái)州椒江玻璃儀器廠；Avatar370傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵花多糖的提取及提取率的測定

1.3.1.1 黃秋葵花多糖的超聲提取工藝

按照Wang Wenjun等[10]所報(bào)道的工藝條件提取，提取溫度為60 ℃，按1∶40（m/V）的料液比加入蒸餾水，在95 W的功率下提取30 min，將提取液離心并收集上清液，加入3 倍體積95%乙醇溶液，4 ℃下沉淀過夜，離心；沉淀物依次用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液、無水乙醇洗滌，復(fù)溶，透析48 h，凍干得到樣品（CUOFP）備用。

1.3.1.2 黃秋葵花多糖的酶法提取工藝

根據(jù)李文德等[11]報(bào)道的方法并略作修改，準(zhǔn)確稱取黃秋葵花粉20 g，使用纖維素酶，加酶量為1%（以黃秋葵花粉質(zhì)量計(jì)），料液比為1∶40（m/V），用pH 4.8的檸檬酸緩沖液作為溶劑，在50 ℃下水浴提取3 h，按1.3.1.1節(jié)方法收集上清液，醇沉，離心，復(fù)溶，透析，凍干得到樣品（CEOFP）備用。

1.3.1.3 黃秋葵花多糖的酸法提取工藝

采用劉曉霞[7]優(yōu)化的方法，準(zhǔn)確稱取黃秋葵花粉20 g，料液比1∶30（m/V），加入pH 1.6的鹽酸溶液，水浴溫度為90 ℃，提取2.5 h，按1.3.1.1節(jié)方法收集上清液，經(jīng)醇沉、離心、復(fù)溶、透析、凍干得到樣品（CAOFP）備用。

1.3.1.4 黃秋葵花多糖的熱水浸提工藝

按Zhu Zhenyuan等[12]報(bào)道的方法制備并進(jìn)行一定的修改，準(zhǔn)確稱取黃秋葵花粉20 g，按料液比1∶30（m/V）加入蒸餾水，在80 ℃下水浴提取2 h，按1.3.1.1節(jié)方法收集上清液，醇沉，離心，復(fù)溶，透析，凍干得到樣品（CHOFP）備用。

1.3.1.5 黃秋葵花多糖提取率的計(jì)算

黃秋葵花多糖提取率的計(jì)算參照文獻(xiàn)[7]，計(jì)算公式如式（1）所示。

1.3.2 黃秋葵花多糖的一般理化特性分析

黃秋葵花多糖的一般理化特性分析參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用咔唑比色法。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用考馬斯亮藍(lán)法?？偡淤|(zhì)量分?jǐn)?shù)采用福林-酚法測定。

1.3.3 黃秋葵花多糖的分子質(zhì)量分析

黃秋葵花多糖的分子質(zhì)量分析參照文獻(xiàn)[13]。激光光散射法可以精確分析多糖的重均分子質(zhì)量（mW）及其分布和均方根旋轉(zhuǎn)半徑折光率增量dn/dc為0.138 mL/g，進(jìn)樣量為200～300 μL，數(shù)據(jù)收集60 min，柱溫為室溫，流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3溶液（含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% NaN3）。稱取3 mg樣品溶解于1 μL的0.1 mol/L NaNO3溶液中，磁力攪拌溶解4 h，過0.22 μm濾膜，備用。采用ASTRA軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和計(jì)算。

1.3.4 黃秋葵花多糖的單糖組成分析

1.3.4.1 多糖組分的完全酸水解

稱取2 mg樣品于安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，封管，置于110 ℃烘箱中酸解8 h，待反應(yīng)完全后冷卻至室溫，用氮吹儀吹干，即可得到水解后的單糖混合物。加少量蒸餾水溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整樣品pH值至中性，用蒸餾水定容至1 mL備用。

1.3.4.2 PMP柱前衍生-高效液相色譜法分析單糖組成

衍生物制備：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)單糖，等物質(zhì)的量混合配制成濃度為2 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液。吸取400 μL標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液（加乳糖作為內(nèi)標(biāo)）和上述水解樣品，加入450 μL的0.3 mol/L NaOH溶液和450 μL的0.5 mol/L PMP溶液，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)30 min。加入450 μL的0.3 mol/L HCl溶液，加1 mL氯仿萃取，重復(fù)兩次，取上層水層過0.45 μm水系膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。

色譜條件：XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測波長250 nm，柱溫為25 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相：溶劑A為體積分?jǐn)?shù)15%乙腈和0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（KH2PO4-NaOH，pH 6.8），溶劑B為體積分?jǐn)?shù)40%乙腈和0.05 mol/L PBS（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）；梯度洗脫模式：時(shí)間梯度為0 min→10 min→30 min→35 min→40 min，相應(yīng)溶劑B體積分?jǐn)?shù)梯度為0→15%→25%→25%→0。

多糖組分的單糖物質(zhì)的量之比計(jì)算：多糖樣品中的單糖組成分析和計(jì)算方法主要是以乳糖為內(nèi)標(biāo)，按公式（2）計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)單糖的定量矯正因子fi/Luc。樣品中各單糖的物質(zhì)的量之比為峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比乘以fi/Luc所得，樣品的單糖相對(duì)含量以單糖的物質(zhì)的量之比來表示。

式中：fi/Luc為該單糖的校正因子；Ai為標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積；ni為標(biāo)準(zhǔn)單糖的物質(zhì)的量/mmol；ALuc為內(nèi)標(biāo)的峰面積；nLuc為內(nèi)標(biāo)的物質(zhì)的量/mmol。

1.3.5 黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜檢測

黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜檢測參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。取樣品約2 mg，置于干燥的瑪瑙碾缽中，在紅外燈干燥的條件下加入溴化鉀約0.5 g，碾勻，壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.3.6 黃秋葵花多糖特性黏度分析

黃秋葵花多糖特性黏度分析參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。用蒸餾水作為溶劑，多糖樣品過夜充分溶解，分別配制得到多糖溶液作為待測液。將烏氏黏度計(jì)垂直固定于恒溫水槽內(nèi)，溫度控制為（25.0±0.1）℃。移取8 mL蒸餾水加入到烏氏黏度計(jì)中，恒溫15 min。按烏氏黏度計(jì)的使用方法，測定溶劑流出時(shí)間T0。移取8 mL待測樣品溶液加入到烏氏黏度計(jì)中，恒溫15 min，測定樣品溶液流經(jīng)兩刻度線間的時(shí)間，重復(fù)3 次，取平均值記為T1。依次加入4、4、8 mL的蒸餾水，稀釋混勻，使溶液濃度為初始濃度的2/3、1/2、1/3，并恒溫15 min，然后測定稀釋后溶液流經(jīng)兩刻度線間的時(shí)間。每次測定重復(fù)至少3 次，最大值與最小值之間相差不得超過0.5 s，最終流出時(shí)間取3 次測量值的平均值。分別計(jì)算不同樣品溶液的相對(duì)黏度（ηr）、增比黏度（ηsp）和比濃黏度（ηsp/c）（式（3）～（5））。作圖得到Huggins方程和Kraemer方程，外推可得到共同的截距，即為特性黏度[η]。

特性黏度[η]是反映聚合物占據(jù)的流體動(dòng)力學(xué)體積的參數(shù)，其值的測量在生物大分子表征中具有重要意義[24]。常用Huggins方程（式（6））、Kraemer方程（式（7））來表示聚合物溶液的黏度與濃度的關(guān)系。

式中：k是Huggins常數(shù)；k’是斜率。

[η]的大小主要取決于聚合物的分子質(zhì)量和鏈剛性以及溶劑特性、溫度[25]。而當(dāng)聚合物的溶劑、溫度一定時(shí)，[η]只與聚合物的分子質(zhì)量有關(guān)，分子質(zhì)量越大，則表現(xiàn)出的[η]也越大[26]。

1.3.7 多糖的體外抗氧化活性測定

采用離子交換層析純化，除去黃秋葵花多糖中的小分子雜質(zhì)。將不同方法提取得到的多糖樣品溶于蒸餾水中，離心后上清液用DEAE-Q Sepharose Fast Flow分離，依次用蒸餾水、0.7 mol/L與0.8 mol/L的NaCl洗脫，收集0.7 mol/L NaCl的洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥后得到樣品備用。

1.3.7.1 FRAP測定

按照黃海智[15]的測定方法，取3.9 mL的Fe3+-TPTR復(fù)合物溶液，加入100 μL樣品，漩渦混合，在37 ℃下孵育10 min，檢測其593 nm波長處的吸光度，吸光度越高表明還原能力越強(qiáng)，同時(shí)采用VC作為陽性對(duì)照。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力測定

按照Imjongjaira等[16]的方法，取300 μL的DPPH溶液（0.2 mmol/L，溶于體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液中），加入300 μL樣品并漩渦混合，同時(shí)用VC作為對(duì)照。在避光室溫的條件下反應(yīng)30 min，于517 nm波長處檢測其吸光度，記為A樣品。DPPH自由基清除率按式（8）計(jì)算。

1.3.7.3 ABTS+·清除能力測定

實(shí)驗(yàn)根據(jù)黃海智[15]的方法進(jìn)行測定，取25 mL ABTS儲(chǔ)備溶液（7 mmol/L）和440 μL過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）混合室溫避光條件下反應(yīng)12～16 h制備得到ABTS陽離子溶液。ABTS陽離子溶液用PBS（pH 7.4）稀釋，直到734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02，記為A0。取3.9 mL稀釋后的ABTS陽離子溶液，加入100 μL樣品并漩渦混合，用VC作為對(duì)照。室溫下避光反應(yīng)10 min，734 nm波長處檢測其吸光度。ABTS+·清除率以空白與樣品吸光度的變化率表示。ABTS+·清除率按式（9）計(jì)算。

1.3.7.4 ORAC測定

ORAC測定根據(jù)黃海智[15]的方法并略作修改。熒光素的溶液用75 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）溶解，配成終濃度100.8 nmol/L。隨后在黑底96 孔板加入25 μL的樣品或Trolox溶液和75 μL熒光素鈉溶液，將其在37 ℃下孵育15 min，再將150 μL AAPH磷酸鉀緩沖溶液（38.25 mmol/L）加入到該混合物中。充分振蕩5 s后開始檢測，發(fā)射波長538 nm、激發(fā)波長485 nm，每分鐘測定一次，在37 ℃下連續(xù)測定3 h。結(jié)果以每克干物質(zhì)含Trolox的物質(zhì)的量（μmol Trolox/g）表示。

1.3.7.5 CAA的測定

細(xì)胞抗氧化能力（cellular antioxidant activity，CAA）的測定參照文獻(xiàn)[17]。將100 μL的人肝癌細(xì)胞（HepG2）以60 000 個(gè)/孔的濃度接種到96 孔板中（黑板底透）。37 ℃培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)基，PBS洗滌一次。含有不同樣品濃度的培養(yǎng)基用25 μmol/L的DCFH-DA處理1 h，移除培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，加入100 mL的AAPH溶液。將96 孔板放入熒光酶標(biāo)儀檢測，發(fā)射波長538 nm、激發(fā)波長485 nm連續(xù)檢測1 h，每5 min檢測一次，以每100 g干物質(zhì)含槲皮素物質(zhì)的量（μmol QE/100 g）表示表示細(xì)胞抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、Origin Pro 2016軟件作圖。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對(duì)多糖提取率的影響

4 種提取方法的提取率由高到低分別為酶法提?。ǎ?1.90±0.14）%）、酸法提?。ǎ?5.15±0.07）%）、熱水提?。ǎ?2.60±0.2 8）%）、超聲輔助提?。ǎ?2.02±0.37）%）。通過提取率的比較可知，采用纖維素酶輔助提取的方法所得粗多糖的得率最高，表明黃秋葵花中的多糖部分與細(xì)胞壁的纖維素和半纖維素結(jié)合，纖維素酶能夠水解和破壞纖維素網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)多糖的溶出，這個(gè)結(jié)果與Zhu Zhenyuan[12]和Yuliarti[18]等的研究結(jié)果一致。此外，酶法和酸法所用的提取溶劑為酸性，能夠使一部分非水溶性多糖轉(zhuǎn)化為水溶性多糖，提取率升高。熱水提取與超聲輔助提取法都以去離子水為提取劑，兩者的提取率比較接近，但超聲提取方法所用的時(shí)間比熱水提取的短。這可以歸因于超聲波的空化效應(yīng)對(duì)物料的組織和細(xì)胞壁產(chǎn)生破壞，使物料和溶劑之間有更大的接觸面積，多糖更易溶出，提高了提取效率[19]。

2.2 黃秋葵花多糖的一般理化特性

由表1可見，提取方法對(duì)半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的影響，4 種不同方法得到多糖CAOFP、CEOFP、CUOFP、CHOFP的半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（52.63±2.13）%、（39.51±1.47）%、（31.97±1.30）%、（29.34±1.31）%，其中CAOFP的半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。在酸性條件下，有更多非水溶性果膠多糖轉(zhuǎn)化為水溶性果膠多糖[7]，因此采用酸法和酶法提取得到的CAOFP、CEOFP半乳糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)要高于用純水作為提取劑的CUOFP、CHOFP。

4 種粗多糖中都含有除糖類物質(zhì)以外的其他成分，而這些成分很可能與糖類基團(tuán)是緊密相連的，如蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)等，會(huì)在提取及醇沉的過程中混入樣品。而表1中的結(jié)果顯示CUOFP中所含的蛋白質(zhì)與總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他方法，可能是超聲波對(duì)黃秋葵花的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)造成了更大的破壞，釋放出了更多的非多糖成分[18]。

表 1 不同提取方法的黃秋葵花多糖的化學(xué)組成Fig. 1 Chemical composition of polysaccharides obtained using different extraction methods

2.3 黃秋葵花多糖的分子質(zhì)量

表 2 不同提取方法的黃秋葵花多糖分子質(zhì)量Fig. 2 Molecular mass of polysaccharides obtained using different extraction methods

如表2所示，CHOFP和CEOFP都發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)組分，表明黃秋葵花粗多糖中既含有分子質(zhì)量較大的組分，也有分子質(zhì)量較小的組分。CEOFP具有最高的（233.2 nm）和mW（4 780 kDa）；CAOFP多分散系數(shù)大，分布較寬，這與劉曉霞[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與其他3 個(gè)樣品相比，CUOFP的mW（207 kDa）相對(duì)較小，并且多分散系數(shù)接近1，說明該樣品多糖較為均一。

超聲波的空化效應(yīng)不僅促進(jìn)多糖的溶出，還會(huì)導(dǎo)致部分多糖的降解，形成分布更加平均的小分子多糖。研究表明，經(jīng)一定強(qiáng)度超聲處理的大粒車前子多糖分子質(zhì)量明顯下降，分子質(zhì)量分布會(huì)變窄[20]。已有文獻(xiàn)報(bào)道熱水回流提取和酸法提取的黃秋葵花多糖分子質(zhì)量分別為1 700、1 300 kDa，這種差異主要是由不同的實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算方法引起的[7,21]。

2.4 黃秋葵花多糖的單糖組成

采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法檢測黃秋葵花多糖的單糖組成，通過比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，不同提取方法得到的黃秋葵花多糖的單糖組成物質(zhì)的量之比如表3所示。4 種提取方法所得的黃秋葵花多糖樣品具有相同的單糖組成，而相對(duì)含量有所不同。4 種樣品都由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖組成，這9 種單糖中主要以鼠李糖、半乳糖醛酸和半乳糖居多，這與劉曉霞[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，說明黃秋葵花多糖是一類酸性雜多糖。其中，鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖與半乳糖醛酸一起出現(xiàn)表明多糖鏈上可能存在分支且分支程度與提取方法有關(guān)，CUOFP中性多糖相對(duì)含量高，說明多糖結(jié)構(gòu)支化程度更高[18,22]。酸法提取對(duì)組織中纖維素、半纖維素等組分有增溶作用，因此產(chǎn)物CAOFP中含有更多的葡萄糖，可能就是來自纖維素的降解[23]。

表 3 不同提取方法的黃秋葵花多糖的單糖相對(duì)含量Fig. 3 Monosaccharide relative content of polysaccharides obtained using different extraction methods

2.5 黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜

圖 1 不同提取方法的黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of polysaccharides obtained using different extraction methods

如圖1所示，4 種多糖在3 385 cm-1附近都出現(xiàn)了強(qiáng)而寬的吸收峰，這是O—H伸縮振動(dòng)的結(jié)果，表明多糖的分子內(nèi)和分子間均存在氫鍵。2 930 cm-1附近的吸收峰為C—H的振動(dòng)。1 400～1 200 cm-1處的吸收峰為C—H的變形振動(dòng)，表明樣品為多聚糖組分。1 724 cm-1的吸收峰處為酯鍵羰基（—COOR）形成的伸縮振動(dòng)，其中CAOFP在此處的吸收峰比其他樣品強(qiáng)，但初步判斷所得的多糖為低酯多糖；1 615 cm-1附近為羧基的羰基C＝O伸縮振動(dòng)，可能是羧酸或羧酸鹽。1 417 cm-1的峰是C—H變角振動(dòng)峰。在1 017 cm-1處的吸收峰是糖苷鍵C—O—C非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，說明多糖中都存在吡喃環(huán)構(gòu)象。在895 cm-1處的吸收峰表明多糖中存在β-構(gòu)型糖。

2.6 黃秋葵花多糖的特性黏度

本實(shí)驗(yàn)中，[η]CEOFP（10.63 dL/g）＞[η]CHOFP（10.55 dL/g）＞[η]CAOFP（2.33 dL/g）＞[η]CUOFP（1.94 dL/g），這表明不同提取方法影響了多糖的特性黏度，這與分子質(zhì)量測定的結(jié)果相符，CEOFP的分子質(zhì)量最大而CUOFP分子質(zhì)量最小。Yan Jingkun等[27]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠明顯降低桑黃菌絲多糖的特性黏度。Kontogiorgos等[24]測得黃秋葵多糖的特性黏度范圍在0.41～2.71 dL/g，Ndjouenkeu等[28]報(bào)道黃秋葵多糖的特性黏度為7.6 dL/ g，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，但同時(shí)也反映了提取方法和原材料本身對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)特征會(huì)產(chǎn)生較大的影響。研究發(fā)現(xiàn)多糖的黏度過大，則在實(shí)際生產(chǎn)和加工的應(yīng)用中會(huì)受到很大的限制[14]，Zhu Zhenyuan等[12]也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，較小的多糖特性黏度有利于其流動(dòng)以及附著于腫瘤細(xì)胞，因此具有更好的腫瘤抑制活性。而經(jīng)超聲提取得到的黃秋葵花多糖，特性黏度明顯下降，這對(duì)進(jìn)一步的加工和利用多糖是有利的。

2.7 黃秋葵花多糖的體外抗氧化活性

圖 2 不同提取方法的黃秋葵花多糖的離子交換層析純化Fig. 2 Elution profiles of crude polysaccharides extracted by different methods

為了排除酚類、黃酮等物質(zhì)對(duì)多糖抗氧化活性評(píng)價(jià)的影響，黃秋葵花多糖樣品經(jīng)離子交換柱脫色，結(jié)果見圖2。經(jīng)0.8 mol/L的NaCl洗脫的組分沒有多糖出現(xiàn)，觀察洗脫組分發(fā)現(xiàn)有色素出現(xiàn)，而經(jīng)0.7 mol/L的NaCl洗脫的組分沒有色素且含有全部的多糖。將CEOFP、CAOFP、CHOFP、CUOFP除去小分子雜質(zhì)后得到的多糖分別命名為EOFP、AOFP、HOFP、UOFP。

圖 3 黃秋葵花多糖的FRAPFig. 3 FRAP of okra flower polysaccharides

2.7.1 黃秋葵花多糖的FRAP圖3顯示了VC及4 種不同方法得到的黃秋葵花多糖在1～8 mg/mL下的鐵離子還原抗氧化力，多糖樣品和

VC的還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而增大，但多糖的還原能力與VC具有顯著的差距。多糖分子中含有大量的羥基基團(tuán)，能夠作為電子供體，將Fe3+還原成Fe2+，從而使黃秋葵花多糖具有一定的鐵離子還原抗氧化活性。由圖3可知，UOFP的還原能力明顯強(qiáng)于其他3 種多糖。

Shen Shian等[29]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超聲提取的油茶餅多糖的還原能力明顯高于酶法、堿法、熱水提取的樣品；Li Jinwei

等[23]比較超聲提取和熱水法提取的駿棗多糖樣品，其中超聲提取的多糖的Fe3+還原力高于熱水法提取的多糖，說明在超聲提取過程中可能提取到了更多關(guān)鍵的生物活性物質(zhì)或者使其發(fā)生一些結(jié)構(gòu)或化學(xué)變化。

2.7.2 黃秋葵花多糖的DPPH自由基清除能力

圖 4 黃秋葵花多糖的DPPH自由基清除能力Fig. 4 Scavenging effects of okra flower polysaccharides on DPPH free radicals

如圖4所示，對(duì)于所有樣品，清除DPPH自由基的能力都具有劑量依賴關(guān)系，清除率在黃秋葵花多糖質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL的范圍內(nèi)明顯上升。其中，VC的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.01 mg/mL，UOFP的IC50為（0.83±0.01）mg/mL，HOFP的IC50為（2.45±0.01）mg/mL，EOFP和AOFP的IC50都大于4 mg/mL。4 種多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)弱依次為UOFP＞HOFP＞EOFP＞AOFP，UOFP的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)采用熱水浸提法從黃秋葵中提取的多糖有一定的DPPH自由基清除能力，不同組分的IC50不同，并具有劑量依賴的關(guān)系[30]。超聲提取過程中可能暴露出了更多的活性基團(tuán)，其降解效應(yīng)也能夠?qū)Χ嗵堑腄PPH自由基清除能力產(chǎn)生影響[31-32]。

2.7.3 黃秋葵花多糖的ABTS+·清除能力

圖 5 黃秋葵花多糖的ABTS＋·清除能力Fig. 5 Scavenging effects of okra flower polysaccharides on ABTS＋·

由圖5可知，所有多糖樣品ABTS+·的清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。通過比較4 種多糖樣品的IC50可知，UOFP的ABTS+·清除效果最好，其他多糖樣品的IC50均大于8 mg/mL，且與VC相比清除能力相對(duì)較弱。與DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，有研究表明超聲對(duì)多糖活性有積極的影響，可以有效提高多糖的自由基清除能力和體外抗氧化活性[27]。

2.7.4 黃秋葵花多糖的ORAC

4 種多糖的O R A C由大到小分別為U O F P（（151.15±1.23）μmol Trolox/g）、HOFP（（144.44±0.27）μmol Trolox/g）、EOFP（（6 1.7 5±0.5 5）μ m olT r olo x/g）、A O F P（（31.77±0.59）μmol Trolox/g）。結(jié)果表明，在適宜的條件下超聲提取可以在一定程度上提高多糖的生物活性。多糖中含有的一些極性基團(tuán)對(duì)其抗氧化能力指數(shù)具有較大影響，還原能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果也同樣具有相近的結(jié)果。研究表明多糖的分子質(zhì)量、糖醛酸含量、單糖組成與其抗氧化能力相關(guān)[33]。

2.7.5 黃秋葵花多糖的CAA

雖然化學(xué)抗氧化方法能夠非常有效地篩選抗氧化物質(zhì)，但是它們不能準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)在生物體內(nèi)的活性。細(xì)胞抗氧化活性篩選方法涉及細(xì)胞吸收、分布和代謝，能提供更可靠的抗氧化活性的生物學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果，可以克服化學(xué)測定的一些缺點(diǎn)，成為了一種重要的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法[34]。

多糖樣品的CAA分別為UOFP（（892.85±27.95）μmol QE/100 g）、AOFP（（473.86±18.56）μmol QE/100 g）、HOFP（（91.11±3.10）μmol QE/100 g），其中UOFP具有最好的CAA，而EOFP在實(shí)驗(yàn)中沒有檢測到CAA。

3 結(jié) 論

采用了4 種提取方法：熱水提取、酸法提取、酶法提取、超聲輔助提取黃秋葵花中的多糖，分別得到CHOFP、CAOFP、CEOFP、CUOFP 4 種多糖。其中酶法提取的得率最高，為（21.90±0.14）%。4 種多糖都富含半乳糖醛酸，且含有少量蛋白質(zhì)、酚類等。通過分析多糖的分子質(zhì)量、單糖組成、傅里葉變換紅外光譜，結(jié)果表明得到的4 種多糖樣品都具有多糖的典型傅里葉變換紅外光譜特征；它們的單糖組成成分相同，主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖組成，但不同樣品的單糖物質(zhì)的量之比有所不同；酶法提取和熱水提取的多糖樣品CEOFP、CHOFP分子質(zhì)量和特性黏度較大，而超聲提取能顯著降低多糖的特性黏度和分子質(zhì)量且使分子質(zhì)量的分布變窄。

對(duì)4 種多糖的DPPH自由基清除能力、ORAC、ABTS+·清除能力、FRAP和CAA進(jìn)行測定，結(jié)果表明4 種多糖具有不同程度的抗氧化活性，且具有劑量依賴性。相對(duì)于其他3 種提取方法，超聲輔助提取的多糖在實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗氧化活性，說明超聲輔助提取的方法可能對(duì)多糖的生物活性產(chǎn)生了有利的影響。