張 鶴，張 瑩，楊逢建，祖元?jiǎng)?，陳小?qiáng)*

（東北林業(yè)大學(xué) 森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物資源生態(tài)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室（黑龍江），黑龍江 哈爾濱 150040）

自由基是機(jī)體在生化反應(yīng)中產(chǎn)生的性質(zhì)活潑且具有極強(qiáng)氧化功能、可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷和機(jī)體衰老的物質(zhì)[1]。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)時(shí)，攝入外源性抗氧化劑有可能逆轉(zhuǎn)這種脅迫，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的侵害，進(jìn)而阻止或延緩許多慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展[2-4]。研究表明，許多植物提取物和植物化學(xué)成分對(duì)維持體內(nèi)的自由基平衡具有重要作用，或可直接清除自由基，或可直接對(duì)抗自由基脅迫造成的組織或細(xì)胞損傷，還可增強(qiáng)機(jī)體本身的抗氧化酶系統(tǒng)，從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制體內(nèi)自由基過(guò)多帶來(lái)的生理性損傷作用[1]，許多植物源提取物[5]和酚類(lèi)[6]、黃酮類(lèi)[7]、醌類(lèi)[8]、皂苷[9]、多糖[10]、生物堿[11]等化學(xué)成分均已被證實(shí)具有很好的抗氧化活性。

向日葵（Helianthus annuus L.）為菊科向日葵屬植物，一年生高大草本，原產(chǎn)于北美洲，世界各國(guó)均有栽培[12]。向日葵是僅次于棕櫚、大豆和油菜的主要油料作物[13]，同時(shí)有很高的藥用價(jià)值，其葉、花、花盤(pán)、果殼、根、莖內(nèi)髓心（向日葵莖髓）均可入藥，其中向日葵莖髓具有清熱、利尿、止咳的功效，主治淋濁、白帶、乳糜尿、百日咳、風(fēng)疹[14]。研究表明，向日葵的化學(xué)成分主要為倍半萜、二萜、倍半萜內(nèi)酯、三萜類(lèi)等萜類(lèi)化合物[15]，還含有甾醇、香豆素[15]、酚類(lèi)[16-17]、黃酮類(lèi)[18-19]和揮發(fā)性化合物[20]。秸稈是向日葵產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物之一，多被當(dāng)作燒柴甚至被廢棄[21]，其本身所具有的食藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值尚未引起足夠的重視，其酚類(lèi)、黃酮類(lèi)抗氧化成分含量及活性的相關(guān)研究也鮮有開(kāi)展。為此，本實(shí)驗(yàn)中選取向日葵莖髓為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定其乙醇提取物的不同極性萃取部位的總酚和總黃酮含量及抗氧化活性的異同，并進(jìn)行其相關(guān)性分析，可為向日葵莖髓的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考，對(duì)于提高向日葵資源利用率和綜合經(jīng)濟(jì)效益以及環(huán)境保護(hù)均具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

向日葵莖植物材料于2015年秋季采集于黑龍江省哈爾濱市，由東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為菊科植物向日葵（H. annuus L.）的干燥莖。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、福林-酚試劑 上海源葉生物科技有限公司；2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ） 美國(guó)Fluka公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、過(guò)硫酸鉀、乙酸鈉 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；水溶性VE（Trolox） 加拿大TRC公司；所有提取溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī) 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海一科儀器有限公司；752N型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；JJ124BC型電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 不同極性萃取部位的制備

剝?nèi)∠蛉湛o髓，風(fēng)干并粉碎，過(guò)40 目篩，精密稱(chēng)取莖髓粉末100 g于錐形瓶中，按料液比1∶30（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在功率為100 W、溫度為40 ℃的條件下超聲提取3 次，每次30 min，合并3 次提取液，過(guò)濾，減壓回收溶劑至提取物無(wú)醇味。將乙醇提取物用適量去離子水充分混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，減壓回收溶劑，得到向日葵莖髓石油醚萃取部位（PE）、乙酸乙酯萃取部位（EE）和正丁醇萃取部位（BE），－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

各萃取部位總酚含量通過(guò)福林-酚法進(jìn)行測(cè)定[22]，稍作改動(dòng)。依次向試管中加入0.2 mL萃取部位溶液、0.8 mL蒸餾水、0.2 mL福林-酚試劑，混勻并室溫靜置5 min，依次加入2 mL 0.07 g/mL碳酸鈉溶液、1.6 mL蒸餾水，混勻后常溫避光反應(yīng)90 min，于波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度。各樣品的總酚含量參考標(biāo)準(zhǔn)曲線用每克干樣品中酚類(lèi)化合物相當(dāng)于沒(méi)食子酸的質(zhì)量表示（mg/g）。所有樣品均測(cè)定3 次。

1.3.3 總黃酮含量的測(cè)定

各萃取部位總黃酮含量依據(jù)文獻(xiàn)[23]方法測(cè)定，稍作改動(dòng)。將萃取部位配制成100 mg/mL的待測(cè)溶液備用。取2.4 mL待測(cè)樣品溶液與0.3 mL 0.05 g/mL亞硝酸鈉溶液混勻靜置；6 min后加入0.3 mL 0.10 g/mL硝酸鋁溶液，混勻靜置；5 min后加入4 mL 0.04 g/mL氫氧化鈉溶液，待反應(yīng)液充分混勻15 min后，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。總黃酮含量以每克干樣品中黃酮類(lèi)化合物相當(dāng)于蘆丁的質(zhì)量表示（mg/g）。所有樣品均測(cè)定3 次。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[24]，稍作改動(dòng)。用甲醇將DPPH配制成60 μmol/L的溶液，將向日葵莖髓萃取部位配制成50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/mL的樣品液，量取0.1 mL樣品溶液與0.9 mL DPPH溶液充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇作為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。DPPH自由基清除率按公式（1）計(jì)算，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。再根據(jù)系列質(zhì)量濃度下的清除率計(jì)算出半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A空白為0.9 mL DPPH溶液與0.1 mL甲醇溶液混合后的吸光度；A樣品為0.9 mL DPPH溶液與0.1 mL樣品溶液混合后的吸光度。

1.3.5 ABTS+·清除能力的測(cè)定

ABTS+·清除能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[5]，稍作改動(dòng)。將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液按0.5∶1.0（V/V）混勻，室溫避光靜置12～16 h，得到ABTS儲(chǔ)備液。將此儲(chǔ)備液與蒸餾水按照1∶20（V/V）混合，在734 nm波長(zhǎng)處調(diào)節(jié)吸光度為0.80±0.02，得到ABTS工作液。取0.1 mL萃取部位樣品溶液分別與3.9 mL的ABTS工作液混勻，避光反應(yīng)10 min后于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。按公式（2）計(jì)算樣品對(duì)ABTS+·的清除率。

式中：A空白為0.1 mL對(duì)應(yīng)溶劑與3.9 mL ABTS工作液混合后的吸光度；A樣品為0.1 mL樣品與3.9 mL ABTS工作液反應(yīng)后的吸光度。

用不同濃度Trolox溶液重復(fù)以上操作，以ABTS+·清除率/%為縱坐標(biāo)，以Trolox溶液濃度/（μmol/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品ABTS+·清除能力用每克干樣品的Trolox當(dāng)量表示（μmol/g）。

1.3.6 FRAP測(cè)定

鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測(cè)定參考文獻(xiàn)[25]，稍作改動(dòng)。將0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、l0 mmol/L TPTZ溶液（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L氯化鐵溶液按10∶1∶1（V/V）混勻，得到FRAP工作液。取0.1 mL萃取部位樣品溶液加入到2.45 mL FRAP工作液中，充分混合，暗反應(yīng)60 min，于波長(zhǎng)593 nm處測(cè)定其吸光度。用不同濃度Trolox溶液重復(fù)以上操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（以Trolox溶液濃度/（μmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)）。樣品FRAP用每克樣品的Trolox當(dāng)量表示（μmol/g）。

1. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各萃取部位中的總酚、總黃酮含量分析

表 1 向日葵莖髓各萃取部位總酚、總黃酮的含量Table 1 Contents of total phenols and total flavonoids in different solvent extracts of sunflower stalk pith

由表1可知，總酚和總黃酮在不同極性萃取部位中的含量差異明顯：其中以EE中的總酚、總黃酮含量最高，分別為（1.60±0.10）mg/g和（20.50±1.55）mg/g；其次是PE，分別為（1.00±0.03）mg/g和（5.37±1.54）mg/g。3 種萃取部位的總酚、總黃酮含量的單因素方差分析和多重比較（Duncan法）結(jié)果顯示：PE與EE、EE與BE及PE與BE總酚含量之間均有顯著性差異（P＜0.05），總酚含量大小依次為EE＞PE＞BE；EE與PE、EE與BE總黃酮含量之間均有顯著性差異（P＜0.05），總黃酮含量大小依次為EE＞PE＞BE。因此，乙酸乙酯從向日葵莖髓乙醇提取物中富集的酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分含量最高，可見(jiàn)其對(duì)乙醇提取物中酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分的初步分離是有效的。

2.2 DPPH自由基清除能力分析

圖 1 向日葵莖髓各萃取部位對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Fig. 1 Scavenging effects of different solvent extracts from sunflower stalk pith on DPPH radicals

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度在0.78～25.00 mg/mL之間時(shí)，不同萃取部位清除DPPH自由基的能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。在樣品質(zhì)量濃度為3.13 mg/mL時(shí)，EE對(duì)DPPH自由基的清除率為53.76%，高于PE（23.81%）和BE（21.26%）。

3 種萃取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力由大到小順序?yàn)镋E＞PE＞BE。PE和BE對(duì)DPPH自由基清除率的IC50分別為（13.92±0.85）mg/mL和（36.64±1.23）mg/mL，均高于EE（（2.56±0.10）mg/mL），且差異顯著（P＜0.05），表明不同極性溶劑得到的萃取部位有效成分含量之間存在一定差異，中等極性的EE對(duì)DPPH自由基清除率最高，而小極性的PE和較大極性的BE對(duì)DPPH自由基的清除率較低。但3 種萃取部位中對(duì)DPPH自由基清除能力最好的EE其IC50仍顯著高于VC（未在圖中顯示，（0.05±0.00）mg/mL，P＜0.05）。

2.3 ABTS+·清除能力分析

以T r olo x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y＝0.523 39X-0.005 36，R2＝0.999 5。根據(jù)萃取部位樣品的ABTS+·清除率和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各萃取部位樣品ABTS+·清除能力。

圖 2 向日葵莖髓各萃取部位對(duì)ABTS＋·清除能力的影響Fig. 2 Scavenging effects of different solvent extracts from sun flower stalk pith on ABTS+·

由圖2可知，向日葵莖髓EE的ABTS+·清除能力最強(qiáng)，為（52.00±1.97）μmol/g；其次為PE（（22.63±0.40）μmol/g）；BE活性最低，為（11.53±0.25）μmol/g。不同萃取部位ABTS+·清除率的單因素方差分析和多重比較（Duncan法）結(jié)果顯示，EE對(duì)ABTS+·清除能力與其他兩種萃取部位之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 FRAP分析

以Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y＝0.745 54X+0.099 17，R2＝0.999 3。

圖 3 向日葵莖髓各萃取部位對(duì)FRAP的影響Fig. 3 FRAP activity of different solvent extracts from sunflower stalk pith

由圖3可見(jiàn)，向日葵莖髓EE的FRAP最強(qiáng)，為（120.57±0.74）μmol/g，其次為PE（50.11±1.16）μmol/g和BE（48.00±4.17）μmol/g。不同萃取部位FRAP的單因素方差分析和多重比較（Duncan法）結(jié)果顯示，EE的FRAP與其他兩種萃取部位存在顯著性差異（P＜0.05）。這一檢測(cè)結(jié)果與2.2、2.3節(jié)兩種抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果是一致的，說(shuō)明向日葵莖髓中的抗氧化成分主要集中在中等極性的EE中。

2.5 總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

表 2 向日葵莖髓各萃取部位總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性Table 2 Correlation between antioxidant activities and total phenols and flavonoids contents of extracts from sunflower stalk pith

由表2可知，向日葵莖髓各萃取部位總酚、總黃酮含量與其DPPH自由基、ABTS+·清除能力及FRAP均呈極顯著正相關(guān)，表明萃取部位中總酚、總黃酮含量越高，其對(duì)DPPH自由基和ABTS+·清除能力以及FRAP越強(qiáng)，該萃取部位的抗氧化活性越強(qiáng)。由相關(guān)系數(shù)可知，各萃取部位中總酚含量對(duì)DPPH自由基和ABTS+·清除能力的影響大于總黃酮，而總黃酮含量對(duì)FRAP的影響大于總酚。結(jié)果提示向日葵莖髓各萃取部位中的總酚和總黃酮可能是其具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討 論

從植物中尋找抗氧化活性成分一直是天然產(chǎn)物化學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，天然抗氧化劑主要來(lái)源于植物酚類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物[26]。向日葵中研究較多的具有抗氧化活性的酚類(lèi)成分主要為綠原酸[16-17,27-28]，其研究材料多為向日葵種子或籽粕，而關(guān)于向日葵莖及莖髓中綠原酸含量的報(bào)道較少，文獻(xiàn)[29]顯示成熟期莖髓中綠原酸含量高于0.5 mg/g，但本課題組之前的研究中通過(guò)薄層色譜檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)該成分，推測(cè)原因?yàn)闄z測(cè)方法的靈敏度不夠或?qū)嶒?yàn)材料中綠原酸含量過(guò)低。關(guān)于向日葵中黃酮類(lèi)成分的報(bào)道中，楊樹(shù)平等[30]優(yōu)化了秋季采摘向日葵盤(pán)總黃酮的提取工藝并測(cè)定其含量，在優(yōu)化的工藝條件下（乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h），向日葵盤(pán)中總黃酮得率為33.64 mg/g。高銀祥等[29]對(duì)不同生長(zhǎng)階段的向日葵植株中黃酮和多酚含量進(jìn)行了測(cè)定，其結(jié)果顯示黃酮和多酚在向日葵植株中的分布以花、葉和花盤(pán)為主，成熟期葉和花盤(pán)中黃酮含量分別為8.34 mg/g和9.41 mg/g，而不同生長(zhǎng)階段莖髓中黃酮和多酚含量均較低（低于2 mg/g）。Javed[31]對(duì)生長(zhǎng)期為40 d的向日葵根、莖、葉中的總酚和總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，莖中的總酚和總黃酮含量分別為200.0～256.7 mg/g和45.0～65.7 mg/g。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)論表明，酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分在向日葵莖髓中均有一定積累，這也可能是莖髓醇提物不同萃取部位具有抗氧化活性的原因。本研究測(cè)得莖髓總酚含量約為高銀祥等[29]研究結(jié)果的1.5 倍，但均遠(yuǎn)低于Javed[31]以苗期向日葵植株為材料所測(cè)得的結(jié)果；總黃酮含量約為高銀祥等[29]檢測(cè)結(jié)果的15 倍，約為Javed[31]研究結(jié)果的1/2。不同研究中總酚和總黃酮檢測(cè)結(jié)果存在一定差異，一方面可能是由于實(shí)驗(yàn)材料的原植物生長(zhǎng)環(huán)境、采集時(shí)間等條件不同而導(dǎo)致相關(guān)成分的積累有所差異；另一方面由于酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分種類(lèi)較多，不同極性溶劑和處理方法對(duì)不同成分的溶解性不同，也可能會(huì)使得到的提取物/萃取部位在成分和含量方面存在差異。

植物源酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分含量及種類(lèi)與其抗氧化活性密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同極性溶劑萃取得到的向日葵莖髓萃取部位中酚類(lèi)和黃酮類(lèi)含量均存在顯著差異。綜合DPPH自由基和ABTS+·清除能力以及FRAP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，3 種萃取部位的抗氧化活性強(qiáng)弱依次為EE＞PE＞BE。不同極性向日葵莖髓萃取部位總酚和總黃酮含量與抗氧化活性呈正相關(guān)，這與相關(guān)研究報(bào)道是一致的[32]。由此推斷，中等極性的乙酸乙酯更有利于向日葵莖髓中酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分的萃取，從而影響萃取部位的抗氧化活性。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物源抗氧化活性成分的篩選實(shí)驗(yàn)較多，而對(duì)于抗氧化活性成分的構(gòu)效關(guān)系、作用機(jī)制、抗氧化活性成分間的協(xié)同或拮抗作用等方面仍缺乏系統(tǒng)性研究，尚未形成規(guī)律性的科學(xué)依據(jù)和結(jié)論[33]。因此，向日葵莖髓中酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、抗氧化活性及相互作用等還需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

向日葵莖髓乙醇提取物PE、EE和BE均含有一定量的酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分，且這兩類(lèi)成分都以EE中的含量最高，分別為（1.60±0.10）mg/g和（20.50±1.55）mg/g，與其他兩種極性萃取部位相比具有顯著差異（P＜0.05）。對(duì)3 種萃取部位的DPPH自由基、ABTS+·清除能力和FRAP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其抗氧化能力與總酚和總黃酮含量呈正相關(guān)，即EE在3 種檢測(cè)方法中均具有最優(yōu)的抗氧化活性。相關(guān)性分析結(jié)果表明，3 種萃取部位的抗氧化能力與其含有的總酚和總黃酮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），提示酚類(lèi)和黃酮類(lèi)成分可能是向日葵莖髓具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。