高 芳，李興民，馬鵬飛，曾 心，徐寶才*

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；4.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；5.江蘇雨潤肉食品有限責(zé)任公司，肉品加工與質(zhì)量控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210041）

超高壓技術(shù)是將食品包裝后，放入超高壓容器中，以液體作為傳壓介質(zhì)，施以100～1 000 MPa的壓力處理的一種新興的非熱加工技術(shù)，具有良好的殺菌作用[1]。超高壓的一個(gè)主要特性是作用于非共價(jià)鍵，保證共價(jià)鍵的完整性，從而最大程度地保持食品的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味物質(zhì)[2]。此外，超高壓殺菌的原理主要是破壞細(xì)胞形態(tài)和使細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)變性并流出，從而達(dá)到殺菌保鮮、延長產(chǎn)品貨架期的目的，目前多用于果蔬汁的保鮮[3-5]。低溫肉制品是采用較低溫度（68～85 ℃）進(jìn)行熱加工，將肉制品中心溫度加熱至68～72 ℃保持30 min，在嚴(yán)格的低溫車間（0～4 ℃）條件下生產(chǎn)，在低溫冷鏈條件下運(yùn)輸、銷售的一類熟肉制品[6]。對于低溫肉制品而言，熱殺菌由于溫度的限制往往難以達(dá)到徹底殺菌的目的，對其貯藏存在一定的隱患。超高壓結(jié)合適度的熱處理，會達(dá)到更好的殺菌效果，不僅能夠改善產(chǎn)品的感官品質(zhì)，還能減少熱殺菌帶來的營養(yǎng)損失，很大程度上保持了產(chǎn)品原有的商業(yè)價(jià)值[7]。低溫肉制品由于加工溫度低，存在殺菌不徹底和貨架期短等問題，因此研究以熱壓結(jié)合的方式能否更大程度地減少微生物的數(shù)量級，這種處理方式稱為熱壓結(jié)合滅菌（high pressure thermal sterilization，HPTS）。

耐壓腐敗菌是超高壓處理低溫肉制品后的優(yōu)勢腐敗菌，主要是乳酸菌[8-9]。有研究表明，綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）和腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenterorides）是超高壓處理低溫肉制品中的兩株典型腐敗乳酸菌，也是目前低溫肉制品加工中常見的優(yōu)勢污染微生物[10-12]。Diez等[12]應(yīng)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析了超高壓處理后血腸的微生物多樣性的變化，確定綠色魏斯氏菌和腸膜明串珠菌是優(yōu)勢耐壓腐敗菌。Patterson等[11]從超高壓處理后的雞肉制品中分離到的優(yōu)勢腐敗菌主要為綠色魏斯氏菌。早在1988年Borch等[9]的研究中也發(fā)現(xiàn)，引起該產(chǎn)品腐敗的優(yōu)勢腐敗菌為綠色魏斯氏菌。研究認(rèn)為，綠色魏斯氏菌具備抵抗外界很多不利條件的能力，除能夠耐受超高壓處理外，其他不利條件如有機(jī)酸處理也無法徹底將其殺滅[9,11-13]。以上研究主要采用單一的超高壓手段進(jìn)行處理，殺菌不徹底，且對耐壓乳酸菌的研究主要集中在分離鑒定方面。

失活動力學(xué)模型的意義是可以預(yù)測微生物在特定殺菌條件下的死亡趨勢，使微生物的失活具有一定的規(guī)律可循，因此可為特定微生物在特定條件下的殺菌工藝參數(shù)提供理論依據(jù)。目前，國外有關(guān)超高壓失活動力學(xué)模型的研究較多，但大多集中在產(chǎn)芽孢桿菌類、大腸桿菌和單增李斯特菌等致病菌生長模型上，研究基質(zhì)也多為牛乳和肉類。而對腐敗乳酸菌的失活動力學(xué)研究很少。王衛(wèi)力等[14]構(gòu)建了冷凍魚糜制品中的大腸桿菌的生長模型，選擇了Gompertz模型對生長曲線擬合并獲得了較好的擬合優(yōu)度。馮曉慧等[15]研究了單增李斯特菌在牛肉中的失活模型，選擇了修正后的Gompertz模型擬合了55～70 ℃條件下的熱失活模型。董慶利等[16]研究了豬肉解凍過程中損傷型氣單胞菌的失活模型，最終選擇了Polynomial模型擬合損傷型氣單胞菌的失活過程，達(dá)到了良好的效果。

本實(shí)驗(yàn)主要研究不同的溫度和壓力水平的熱壓結(jié)合處理對耐壓腐敗菌綠色魏斯氏菌在離體和接種煙熏火腿條件下的失活動力學(xué)模型，為低溫?zé)熝鹜戎械哪蛪焊瘮【目刂铺峁┮欢ǖ睦碚撝巍?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耐壓性較強(qiáng)的綠色魏斯氏菌CGMCC1.2494購自中國微生物菌種保藏中心；平板計(jì)數(shù)瓊脂、MRS瓊脂、MRS肉湯 北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、1,2-丙二醇（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司；煙熏火腿切片（180 g）取自江蘇雨潤肉食品有限責(zé)任公司第一生產(chǎn)車間。

1.2 儀器與設(shè)備

SPF-S-1L-100-850-9-W型超高壓處理裝置 英國Stansted Fluid Power公司；FR-400A型手壓式塑料薄膜封口機(jī) 上海森和包裝器材有限公司；XFP-DZ600真空包裝機(jī) 北京鑫飛鵬業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司；HM140234型均質(zhì)機(jī) 日本Toyozumi Dengenkiki公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

活化凍干菌粉，與MRS肉湯混合，調(diào)整菌液濃度為108～109CFU/mL，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）離心洗滌混合液兩次，最后加入一定量的PBS得到乳白色菌懸液，取4 mL分裝于無菌采樣袋中，熱封口，不留頂隙，此即為離體條件樣品。在超凈工作臺中，將紫外殺菌15 min后的煙熏火腿切片正反面各接種100 μL的菌懸液，并用無菌玻璃涂布棒涂抹均勻，置于無菌真空包裝袋中抽真空包裝，室溫下放置40 min左右，讓細(xì)菌充分黏附于火腿樣品表面，此即為接種火腿樣品。兩種樣品均放于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 超高壓處理

壓力的選擇是根據(jù)耐壓實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，耐壓實(shí)驗(yàn)選擇壓力250、350、450 MPa對綠色魏斯氏菌進(jìn)行處理，在200～500 MPa壓力范圍內(nèi)菌有很大的死亡空間，再結(jié)合一定的溫度處理以探究殺菌效果的優(yōu)劣。而溫度的選擇是根據(jù)本研究所選用的介質(zhì)為低溫肉制品，其殺菌溫度在68～72 ℃之間，因此熱殺菌的溫度范圍應(yīng)低于此溫度區(qū)間，經(jīng)過前期的實(shí)驗(yàn)探索，選擇40～50 ℃的熱處理溫度。經(jīng)過不同條件的探索，最終選定兩種樣品分別在40 ℃（300～400 MPa）、45 ℃（400～500 MPa）和50 ℃（400～500 MPa）下處理5～30 min，處理時(shí)間不包括升壓和卸壓時(shí)間，體積分?jǐn)?shù)30%的1,2-丙二醇溶液作為傳壓介質(zhì)。處理結(jié)束后，置于4 ℃中待計(jì)數(shù)處理。每個(gè)處理做3 個(gè)平行。

1.3.3 綠色魏斯氏菌計(jì)數(shù)

微生物經(jīng)受不利條件（超高靜壓、凍融、熱處理、超聲波、輻照、微波等）后存在損傷修復(fù)現(xiàn)象[17-18]，這種受傷狀態(tài)的微生物以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無法檢測，針對這種情況，有學(xué)者研究了培養(yǎng)受傷微生物的薄層平板培養(yǎng)方法[18]。本研究采用此方法對受傷的綠色魏斯氏菌進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

在培養(yǎng)皿中無菌倒入20～25 mL的MRS瓊脂，待其凝固后倒入約10～14 mL的平板計(jì)數(shù)瓊脂，制成薄層平板培養(yǎng)基，紫外燈下凝固備用。超高壓處理后，將煙熏火腿擊碎、混勻，取10 g，稀釋于90 mL無菌生理鹽水中，拍打60 s，充分混勻，取1 mL，一系列梯度稀釋后，選擇3 個(gè)合適的稀釋度，參考GB 4789.2—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行薄層平板涂布計(jì)數(shù)操作，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.4 失活曲線的建立以及模型的選擇和擬合

1.3.4.1 建立失活曲線

記錄熱壓處理后耐受菌的數(shù)量Nt（CFU/mL）和對照樣即未經(jīng)熱壓處理的耐受菌的數(shù)量No（CFU/mL），將計(jì)數(shù)結(jié)果以綠色魏斯氏菌的亡菌數(shù)量級lg（Nt/No）表示，以保壓時(shí)間t為橫坐標(biāo)，亡菌數(shù)量級為縱坐標(biāo)，繪制出不同溫度和壓力結(jié)合條件下的失活曲線。用Curve Expert 1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的線性和非線性方程的擬合，并計(jì)算相應(yīng)的參數(shù)。

1.3.4.2 模型的選擇

一級動力學(xué)模型（Linear）是一種線性模型，假定了熱壓結(jié)合下耐受菌的存活與保壓時(shí)間之間的線性關(guān)系[19]。方程如式（1）所示。

式中：Nt和No同1.3.4.1節(jié)；t表示熱壓結(jié)合處理時(shí)間/min；D表示使90%的耐受菌死亡所需的時(shí)間/min。

Weibull模型，假定了失活曲線是各種致死因素累積的效應(yīng)，描述了營養(yǎng)體和細(xì)胞具有不同的耐受性[20]。方程如式（2）所示。

式中：Nt和No同1.3.4.1節(jié)；n和b是與數(shù)據(jù)范圍和曲線形狀有關(guān)的因子。

log-Logistic模型，此模型最初是由Cole等[21]提出，用來擬合微生物熱失活的非線性模型，后來Chen等[22]對此模型進(jìn)行改進(jìn)，將方程中的參數(shù)減少為4 個(gè)，方程如式（3）所示。

式中：Nt和No同1.3.4.1節(jié)；A表示高低漸近線之差（lg（CFU/mL））；σ表示最大失活速率（lg（CFU/mL）/lg min）；τ表示最大失活速率的對數(shù)時(shí)間（lg min）。

1.3.4.3 模型擬合參數(shù)（評價(jià)因子）

均方差（mean square error，MSE）：MSE值越小，表明模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)越好。其計(jì)算公式如式（4）所示。

式中：n是預(yù)測值的數(shù)量；p是待評估的參數(shù)。

回歸系數(shù)（R2）：R2值越接近于1，表明模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)越好。

準(zhǔn)確因子（Af）：Af值用來評估模型的準(zhǔn)確性，值越接近于1，表明模型的擬合度越好。值越大，表明模型的擬合度越差[23]。其計(jì)算公式如式（5）所示。

式中：n是預(yù)測值的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色魏斯氏菌的耐壓性

前言中提到綠色魏斯氏菌是耐壓菌，為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)擬采用的綠色魏斯氏菌CGMCC1.2494具有超高壓耐受性，特進(jìn)行了耐壓實(shí)驗(yàn)，將制備好的待測菌菌懸液在常溫下分別使用250、350、450 MPa壓力保壓處理10 min，結(jié)果如表1所示。

有研究發(fā)現(xiàn)，綠色魏斯氏菌能夠耐受超高壓[11]和有機(jī)酸[12]處理，同時(shí)也能夠耐受一定濃度的乳酸鏈球菌素處理。由表1可以看出，綠色魏斯氏菌具有很高的耐壓性，在250～450 MPa處理后的菌落數(shù)均在一個(gè)數(shù)量級（8～9之間），驗(yàn)證了綠色魏斯氏菌具有耐壓性，可以進(jìn)行熱壓結(jié)合殺菌實(shí)驗(yàn)。對于微生物抵抗外界不良條件的原因目前研究較少，但從微生物自身角度考慮，不同種屬微生物之間和同種微生物不同菌株之間對壓力的耐受性均不同，對壓力敏感程度也不同[24]。不考慮外界因素，單純從微生物自身角度出發(fā)，綠色魏斯氏菌對壓力的耐受性可能源于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的脂肪酸種類及其組成，其也決定了細(xì)胞膜自身的回復(fù)性[25]；另一方面，壓力的耐受性可能與組成菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的功能活性對壓力的耐受強(qiáng)度有關(guān)[26]。

表 1 綠色魏斯氏菌的耐壓實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Pressure resistance of Weissella viridescens

2.2 超高壓處理裝置在加壓時(shí)腔體內(nèi)的溫度變化

圖 1 熱壓結(jié)合處理時(shí)高壓腔內(nèi)溫度波動Fig. 1 Temperature fluctuation in high pressure chamber during HPTS treatment

在升壓過程中，由于絕熱壓縮加熱導(dǎo)致的溫度波動如圖1所示，在忽略溫度選擇的情況下，壓力越高，由于壓縮加熱升高的溫度也越高，加壓200 MPa升溫6～8 ℃，加壓400 MPa升溫12～14 ℃，加壓500 MPa升溫16～18 ℃。因此，高壓腔體內(nèi)初始溫度應(yīng)該調(diào)整為低于目標(biāo)溫度5 ℃左右，這樣通過一段時(shí)間的升壓，才能使加壓后的溫度不至于超過目標(biāo)溫度，并隨著保壓時(shí)間的延長，溫度迅速降低，慢慢趨近于目標(biāo)溫度附近，以此獲得在保壓時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定的溫度。

由于超高壓升壓期間的絕熱壓縮所導(dǎo)致的溫度急劇升高，因此許多研究者在做熱壓結(jié)合處理對微生物的失活動力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中均考慮了絕熱壓縮所導(dǎo)致的溫度變化，并采取了降低初始溫度的措施。Wang等[27]將初始溫度調(diào)整在60 ℃，經(jīng)過400 MPa、80 ℃升壓處理后，溫度達(dá)到95 ℃，后逐漸穩(wěn)定在80 ℃左右。Shao Yanwen等[28]分別記錄了樣品溫度和腔體溫度，腔體溫度比樣品溫度要高10 ℃左右，熱壓處理?xiàng)l件為700 MPa、80 ℃和800 MPa、100 ℃，因此腔體初始溫度分別設(shè)置為53 ℃和68 ℃，隨著保壓時(shí)間的延長，樣品的溫度逐漸達(dá)到目標(biāo)溫度。

2.3 熱壓結(jié)合處理時(shí)升壓期間綠色魏斯氏菌亡菌數(shù)量級的變化

表 2 兩種不同狀態(tài)的樣品在熱壓結(jié)合處理時(shí)升壓期間綠色魏斯氏菌亡菌數(shù)量級Table 2 Log-reduction of the number of Weissella viridescens in two media during HPTS treatment

熱壓結(jié)合處理時(shí)在升壓期間會產(chǎn)生壓縮加熱，因此造成溫度急劇升高，導(dǎo)致菌的數(shù)量在升壓期間急劇減少一定的數(shù)量級，從表3可以明顯地看出，兩種條件下菌的亡菌數(shù)量級都有一定程度的升高。綠色魏斯氏菌的菌落的數(shù)量級下降1左右，總體上在離體菌液中上升的亡菌數(shù)量級比接種于煙熏火腿的多。升壓期間接種于肉類基質(zhì)中由于大分子物質(zhì)的保護(hù)作用，即使500 MPa壓力更高，也沒有得到比400 MPa產(chǎn)生更好的滅菌效果，這是由于升壓期間的壓力不穩(wěn)定、作用力的不均勻?qū)е聰?shù)據(jù)出現(xiàn)誤差，超高壓的作用力不穩(wěn)定也是一個(gè)有待改正的缺點(diǎn)。在升壓期間導(dǎo)致的菌的失活是不容小覷的，熱壓結(jié)合滅菌的相關(guān)文獻(xiàn)中也有研究：Wang等[27]研究了熱壓結(jié)合處理對芽孢桿菌在離體和接種蘆葦牛肉兩種條件下的滅活效果，闡述了升壓期間的對數(shù)減少量，得出離體條件下的升壓期間菌株的失活量要大于接種于食品基質(zhì)，升壓期間的壓縮加熱對暴露在離體條件下的菌是致命的；Ahn等[29]在熱處理和與超高壓結(jié)合的熱處理對不需氧型菌的失活動力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，升溫和升壓期間菌的失活量均在失活曲線圖中得到了表述，且此期間的失活效果在整個(gè)處理時(shí)間段內(nèi)占據(jù)了主要的作用。

2.4 熱壓結(jié)合處理對綠色魏斯氏菌的失活動力學(xué)模型的擬合

2.4.1 綠色魏斯氏菌在不同熱壓結(jié)合處理?xiàng)l件下的失活曲線

由圖2可以看出，綠色魏斯氏菌在400～500 MPa結(jié)合40 ℃的溫度處理，其亡菌數(shù)量級明顯上升，縱坐標(biāo)是負(fù)值，且負(fù)值越小，表明微生物亡菌數(shù)量級越高。圖2中0 min以后是保壓時(shí)間，0 min以前是升壓階段，圖2也描述了升壓階段兩種介質(zhì)培養(yǎng)菌的亡菌數(shù)量級，可見菌在升壓階段的死亡也是不容忽視的。兩種介質(zhì)培養(yǎng)的菌隨時(shí)間延長數(shù)量級下降，在離體條件下菌的數(shù)量級下降更劇烈，該菌在500 MPa離體條件下處理25 min，能減少8.5 個(gè)數(shù)量級，而該處理水平接種條件下處理相同時(shí)間只能減少2.5 個(gè)數(shù)量級。且在40 ℃下，隨著壓力的升高，下降趨勢更為急劇，菌的死亡數(shù)量更多，很明顯500 MPa壓力獲得了更好的殺菌效果。40 ℃條件下，綠色魏斯氏菌接種火腿中，450 MPa與500 MPa下數(shù)量相差甚少，在保壓時(shí)間15 min以前，500 MPa的滅菌效果更好，而保壓時(shí)間超過15 min后，450 MPa的效果反而好。

圖 4 綠色魏斯氏菌在50 ℃時(shí)的失活曲線Fig. 4 Inactivation curves of Weissella viridescens at 50 ℃

圖3為綠色魏斯氏菌在300～400 MPa壓力水平結(jié)合45 ℃處理溫度下的失活曲線，400 MPa條件，隨著處理時(shí)間的延長，亡菌數(shù)量逐漸增加，而且很明顯，離體條件兩種介質(zhì)培養(yǎng)菌的亡菌數(shù)量更多；但在45 ℃條件下，300 MPa時(shí)，離體條件菌的死亡更急劇，而接種火腿中死亡更平穩(wěn)，而且最終結(jié)果相差不及1 個(gè)數(shù)量級，可能是由于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等能夠?yàn)榫峁┮环N保護(hù)機(jī)制，能夠延緩菌體暴露于危害因素的時(shí)間，進(jìn)而減少相同時(shí)間內(nèi)菌的死亡數(shù)量。在400 MPa離體條件下處理25 min后，綠色魏斯氏菌下降的數(shù)量級比相同處理下接種低溫火腿中要少約6.5 個(gè)。與40 ℃不同的是，在45 ℃、接種低溫火腿的條件下，對綠色魏斯氏菌而言，壓力在400 MPa下的失活效果甚至不及300 MPa。因此又做了50 ℃條件下綠色魏斯氏菌的失活曲線圖（圖4）。從圖3、4中可以明顯看出，在接種煙熏火腿的條件下，400 MPa的失活效果甚至不及300 MPa的壓力水平。由于高壓力水平和較高的溫度之間存在相互抑制的作用，因此效果反而減弱，這就需要在熱壓結(jié)合處理時(shí)充分考慮壓力和溫度水平的選擇，而高壓和高溫拮抗反應(yīng)機(jī)制尚待深入研究。

2.4.2 綠色魏斯氏菌在3 種溫度下失活曲線的模型擬合

圖 5 綠色魏斯氏菌在400 MPa、40 ℃離體和450 MPa、40 ℃接種煙熏火腿的失活曲線擬合模型Fig. 5 Inactivation curves of Weissella viridescens at 400 MPa and 40 ℃ in vitro and 450 MPa and 40 ℃ in situ

圖 6 綠色魏斯氏菌在400 MPa、45 ℃離體條件下的失活曲線擬合模型Fig. 6 Inactivation curves of Weissella viridescens at 400 MPa and 45 ℃ in vitro

圖 7 綠色魏斯氏菌在300 MPa、50 ℃ 離體和接種煙熏火腿的失活曲線擬合模型Fig. 7 Inactivation curves of Weissella viridescens at 300 MPa and 50 ℃ in vitro and in situ

綠色魏斯氏菌在不同溫度和壓力接種條件下擬合3 種模型的曲線如圖5～7所示，從視覺角度看，一級線性模型并不能很好擬合所有的數(shù)據(jù)點(diǎn)，而其余兩種非線性模型的擬合效果從視覺角度看優(yōu)于線性模型。Weibull模型和Logistic模型能較好地描述數(shù)據(jù)點(diǎn)，而且擬合度相差寥寥。因此在模型的選擇過程中，排除線性模型用于擬合超高壓耐受菌的失活動力學(xué)模型。模型的擬合優(yōu)度最終是根據(jù)模型的擬合優(yōu)度參數(shù)值來判斷。擬合模型的數(shù)據(jù)沒有完全呈現(xiàn)。

2.4.3 模型評價(jià)因子

Af值越大表示平均值準(zhǔn)確性越低，而Af值等于1表示預(yù)測值與觀測值之間完全吻合[30]。相關(guān)系數(shù)R2和均方差MSE值表示模型的準(zhǔn)確性，R2越接近于1，MSE值越小，模型的擬合度越高[1]。結(jié)合綠色魏斯氏菌的失活曲線擬合模型以及擬合優(yōu)度參數(shù)的模型評價(jià)因子（表3、4），最適擬合模型顯示在表5中，除綠色魏斯氏菌在400 MPa、45 ℃和50 ℃接種火腿中無法擬合模型外，其余均能很好地?cái)M合模型，可以看出，Logistic模型在較多的熱壓結(jié)合處理?xiàng)l件下是最適的擬合模型，其次是Weibull模型，不能用兩者擬合的選擇MMF模型（在擬合參數(shù)中只用“-”表示），也獲得了較為理想的擬合度。而MMF模型是一種預(yù)測微生物失活模型，表明微生物的失活是一種S型曲線。

表 3 綠色魏斯氏菌在離體條件下的擬合優(yōu)度參數(shù)Table 3 Fitting parameters of Weissella viridescens in vitro

表 4 綠色魏斯氏菌在接種煙熏火腿條件下的擬合優(yōu)度參數(shù)Table 4 Fitting parameters of Weissella viridescens in situ

表 5 綠色魏斯氏菌在不同的壓力、溫度下最適的擬合模型Table 5 Best models describing Weissella viridescens inactivation at different levels of high pressure coupled with moderate heating

2.5 模型的驗(yàn)證

圖 8 綠色魏斯氏菌在40 ℃、350 MPa離體條件和接種煙熏火腿條件下的擬合模型Fig. 8 Comparison of three fitting models for the inactivation curves of Weissella viridescens suspended in vitro and in situ at 40 ℃ and 350 MPa

圖 9 綠色魏斯氏菌在50 ℃、200 MPa離體條件和接種煙熏火腿條件下的擬合模型Fig. 9 Comparison of three fitting models for the inactivation curves of Weissella viridescens suspended in vitro and in situ at 50 ℃ and 200 MPa

通過模型的擬合參數(shù)確定出最適的模型Logistic之后，隨機(jī)挑選兩組條件（40 ℃、350 MPa和50 ℃、200 MPa）對模型進(jìn)行驗(yàn)證，如圖8、9所示，通過對模型擬合參數(shù)的分析，評價(jià)擬合優(yōu)度（表6、7）。通過對擬合參數(shù)的評價(jià)可以看出Logistic模型最適擬合。在溫度范圍40～50 ℃，壓力范圍200～500 MPa以及保壓時(shí)間范圍5～30 min的條件下，模型Logistic適合評價(jià)耐壓腐敗菌在低溫火腿中的失活趨勢。

表 6 兩種驗(yàn)證條件下綠色魏斯氏菌在離體條件下的擬合優(yōu)度參數(shù)Table 6 Fitting parameters of Weissella viridescens inactivation in vitro under validation conditions

表 7 兩種驗(yàn)證條件下綠色魏斯氏菌在接種火腿條件下的擬合優(yōu)度參數(shù)Table 7 Fitting parameters of Weissella viridescens inactivation in situ under validation conditions

3 討 論

超高壓技術(shù)作為一項(xiàng)新興的非熱加工技術(shù)，應(yīng)用于食品主要有兩方面作用：一是用于食品殺菌以延長食品的貨架期；二是生產(chǎn)新的組織結(jié)構(gòu)的食品。超高壓在肉類及其制品中的應(yīng)用主要是肉類殺菌、凍結(jié)與解凍和改善肉品品質(zhì)等方面。肖志華等[31]研究了薺菜制品和生鮮豬肉分別經(jīng)過（200、400 MPa）10 min、600 MPa（5、10、15、20 min）處理后的滅菌情況，該系列處理對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的殺滅效果很好，相應(yīng)存活率最大下降了8.45、5.90 個(gè)對數(shù)值；對生鮮豬肉和芥菜制品中的微生物具有較好的殺滅效果，存活率最大下降了3.45、3.75 個(gè)對數(shù)值。韓衍青等[32]選擇了400 MPa和600 MPa的壓力在12 ℃時(shí)對煙熏切片火腿進(jìn)行10 min保壓處理，發(fā)現(xiàn)該處理能夠有效地抑制火腿中的腐敗微生物，進(jìn)一步延長其貨架期。

本研究中參數(shù)（壓力水平、溫度范圍以及保壓時(shí)間）的選擇都是在前人研究的基礎(chǔ)之上通過進(jìn)一步的摸索而決定，低溫肉制品的殺菌溫度不能超過加工溫度（68～72 ℃），因此在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上選擇溫度水平40、45 ℃和50 ℃。對于綠色魏斯氏菌而言，在40、45 ℃和50℃接種煙熏火腿條件下，壓力越高，反而殺菌效果越不好，這是因?yàn)檩^高的壓力和溫度的拮抗作用導(dǎo)致殺菌效果出現(xiàn)了下降的趨勢；因此，在選擇熱壓結(jié)合處理時(shí)，要充分考慮到壓力和溫度的協(xié)同作用，并考慮超高壓處理裝置的能耗和成本的節(jié)約，選擇適當(dāng)水平的壓力。在選擇溫度和壓力時(shí)，多進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，或選擇響應(yīng)曲面優(yōu)化法優(yōu)化出最適的熱壓結(jié)合殺菌條件。Carlez等[33]發(fā)現(xiàn)較低溫度和漸升溫度協(xié)同超高壓處理能夠?qū)臃N絞碎牛肌肉中的酸桿菌屬、熒光假單胞菌和李斯特菌有較好的殺滅效果。Zhu Songming等[34]對牛肉中產(chǎn)梭狀芽孢桿菌的孢子進(jìn)行超高壓協(xié)同漸升溫度的處理，得到了較好的殺菌效果。離體條件下綠色魏斯氏菌暴露于緩沖液中，相比接種煙熏火腿中的菌缺少了大分子物質(zhì)（脂肪、蛋白質(zhì)、多糖和核酸等）的保護(hù)，經(jīng)超高壓處理之后的菌株數(shù)量升高得更迅速。Wang等[27]對接種芽孢桿菌的蘆葦牛肉和緩沖液中該種菌株所產(chǎn)的孢子的熱壓結(jié)合處理殺菌效果進(jìn)行了研究，得到了同樣的結(jié)論，由于沒有大分子物質(zhì)的保護(hù)，緩沖液中的孢子死亡得更快。

李博等[35]提到預(yù)測微生物學(xué)是建立在計(jì)算機(jī)基礎(chǔ)上的對食品中微生物的生長、殘存和死亡進(jìn)行的數(shù)量化預(yù)測關(guān)系。預(yù)測微生物模型可以為微生物在基質(zhì)中的生長提供一定的參考依據(jù)，使企業(yè)可以在不進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的前提下，快速而便捷地對微生物的生長和產(chǎn)品的貨架期以及安全性作出預(yù)測，從而確定產(chǎn)品的保質(zhì)期、儲藏條件和殺菌方式，極大地減少了工廠產(chǎn)品研發(fā)所需要的測試時(shí)間。本研究選擇一級線性模型和兩種非線性模型（Weibull模型和Logistic模型）對兩種菌的失活曲線進(jìn)行擬合，通過比較各個(gè)模型的擬合參數(shù)來判斷模型的擬合優(yōu)度，最終建立最適的模型，為企業(yè)選擇適當(dāng)?shù)臍⒕鷹l件提供更好的理論依據(jù)。Chen等[22-23]在溫壓結(jié)合對牛乳中單增李斯特菌的失活動力學(xué)研究時(shí)選擇了Weibull模型、Logistic方程和Gompertz方程對失活曲線進(jìn)行擬合，最終選擇Logistic方程進(jìn)行描述。Buzrul等[36]研究了離體條件下的單增李斯特菌在熱壓結(jié)合處理?xiàng)l件下的失活動力學(xué)研究，經(jīng)驗(yàn)證和分析，最終也選擇了log-Logistic模型擬合失活曲線。應(yīng)用Logistic模型可以較好地體現(xiàn)不同熱壓結(jié)合處理下綠色魏斯氏菌在不同基質(zhì)中的死亡情況，很好地預(yù)測超高壓協(xié)同溫度處理低溫肉制品中綠色魏斯氏菌的死亡動態(tài)變化。