（營(yíng)口理工學(xué)院化學(xué)與材料工程系，遼寧營(yíng)口115014）

飲酒已經(jīng)成了人們生活中的一部分，酒精中毒和飲酒過(guò)度所引發(fā)的系列問(wèn)題已經(jīng)危害到人們的生活，尋找解除或降低乙醇對(duì)人體損害的解酒物質(zhì)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[1-10]。葛花（Puerariae flos）又名葛條花，是豆科類植物。葛花中的化學(xué)成分主要是黃酮類化合物、皂苷類化合物、揮發(fā)油類化合物、氨基酸、甾醇類化合物、生物堿等，其中黃酮類化合物含量居多[11-13]。葛花不僅有解酒保肝的功效，對(duì)消化系統(tǒng)也有一定的作用。富里酸是天然的有機(jī)化合物，含有氨基、羧基、羥基等多種基團(tuán)，其可廣泛地應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)療、環(huán)保、食品等領(lǐng)域，同時(shí)還具有醒酒防醉、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)、消炎、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝功能等作用[14-17]。

腺苷是一種內(nèi)源性核苷，它遍布人體細(xì)胞，可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，有益腎保肺、降血脂、抗心律失常作用。目前，對(duì)擬青霉菌中腺苷的提取與檢測(cè)報(bào)道較少[18-19]，課題組采用從富里酸擬青霉菌中得到的腺苷，與葛花提取液、富里酸復(fù)配研制解酒產(chǎn)品，不僅可以解決醉酒傷身的問(wèn)題，而且將有很好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

1 儀器和材料

1.1 儀器

BLF-YB500高速多動(dòng)能粉碎機(jī)：深圳百利福工貿(mào)有限公司；JY系列電子天平、CTH1650臺(tái)式高速離心機(jī)：上海方瑞儀器有限公司；BILON-ZCW-1000W微波·超聲·紫外光催化合成儀：上海比朗儀器有限公司；FD-1C冷凍干燥機(jī)：鞏義市予華儀器有限公司；S6000高效液相色譜儀：華譜科儀（北京）科技有限公司；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 材料

葛花：亳州市永剛飲片廠有限公司；瓊脂、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；紅糖：廣西上上糖業(yè)有限公司；腺苷（99%）：北京百靈威科技有限公司；42°白酒：北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司；甲醇（色譜純?cè)噭簢?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；富里酸：營(yíng)口理工學(xué)院化學(xué)與材料工程系應(yīng)用化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠（體重20 g～25 g）：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 葛花有效成分提取

葛花有效成分的提取采用水做溶劑，使用微波、超聲協(xié)同輔助提取。準(zhǔn)確稱取粉碎過(guò)篩（80目）的葛花粉進(jìn)行微波和超聲輔助提取。

微波和超聲輔助提?。簩⒋嵛锓湃胩崛∑恐邪惭b好儀器，設(shè)置試驗(yàn)參數(shù)，其中微波功率400 W，超聲波功率300 W，溫度80℃，時(shí)間20 min；收集上清液，將上清液冷凍干燥，計(jì)算水溶物提取率，水溶物提取率/%=（水溶物質(zhì)量/干葛花粉質(zhì)量）×100；將提取物封口備用。

2.2 富里酸擬青霉菌的培養(yǎng)與干菌的制備

2.2.1 富里酸擬青霉菌的培養(yǎng)

菌種為富里酸擬青霉菌，是從富里酸中篩選出，用沙氏固體培養(yǎng)基接種好的，為保藏菌種，選擇紅糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2.1.1 培養(yǎng)基的制作

紅糖液體培養(yǎng)基：稱量紅糖→加水加熱溶解→定容→取液→封口滅菌→取出備用稱取40 g紅糖，10 g蛋白胨放入1 L燒杯中，加入500 mL純水，加熱煮沸后，再加純水定容到1 L，完全溶解后，取100mL的液體培養(yǎng)基分別倒入10個(gè)250mL的錐形瓶中，用紗布4層～8層封好瓶口，放入滅菌鍋里滅菌30 min，滅菌后放入超凈臺(tái)備用。

2.2.1.2 富里酸擬青霉菌培養(yǎng)

待滅菌好的紅糖液體培養(yǎng)基冷卻至室溫后開始接菌，將之前在冰箱保存好的富里酸擬青霉菌種（在沙氏瓊脂培養(yǎng)基接種的菌種）取出，在超凈臺(tái)上操作：點(diǎn)燃酒精燈，先用棉花擦手；用火燒一下接種針，待接種針冷卻至室溫，使用接種針在沙氏培養(yǎng)基菌種上刮一下，將接種針上的菌種放入紅糖液體培養(yǎng)基中，接種完成，用紗布封好瓶口，貼上標(biāo)簽“①號(hào)菌”；放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)36 h以形成菌膜，備用。其余9個(gè)液體培養(yǎng)基按相同接種方法接種，分別貼上標(biāo)簽②～⑩號(hào)菌，恒溫培養(yǎng)，備用。

2.2.2 干菌的制備

將①～⑩號(hào)菌中的菌膜取出，用純凈水洗去菌膜上殘留的培養(yǎng)液后，放置到冷凍干燥儀中冷凍干燥12 h，即得到干菌，收集備用。

2.3 富里酸擬青霉菌中腺苷的提取與檢測(cè)

2.3.1 擬青霉菌腺苷的提取

1）準(zhǔn)確稱取富里酸擬青霉菌干菌0.0314g加入30mL純凈水混合。

2）混合液放入反應(yīng)器-微波·超聲·紫外光催化合成儀中，采用微波和超聲波協(xié)同提取擬青霉菌腺苷，設(shè)置提取條件，其中微波功率400 W，超聲波功率400 W，溫度80℃，時(shí)間10 min。

3）高速離心過(guò)濾，收集上清液，標(biāo)記為待測(cè)液。

2.3.2 腺苷檢測(cè)

1）采用高效液相色譜法檢測(cè)腺苷，色譜條件：色譜柱為 Waters×Bridge C18柱，4.6 mm×250 mm 半微型色譜柱（5 μm）；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；流動(dòng)相為水-甲醇（85∶15，體積比）；柱溫 30℃；流速0.5 mL/min；

2）腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用電子天平準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g，加超純水溶解并定容至50 mL，此溶液每1 mL含0.4 mg腺苷；分別吸取 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 mL 于 100 mL 容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，可得0.000 4 mg/mL～0.06 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3）標(biāo)準(zhǔn)樣品分析

系列標(biāo)準(zhǔn)樣品分別按色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，并根據(jù)系列標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4）待測(cè)樣品分析

待測(cè)樣品（樣品液用濾膜過(guò)濾后裝入測(cè)試樣瓶中待測(cè)，分別是待測(cè)液1、待測(cè)液2、待測(cè)液3）分別按色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，外標(biāo)法以峰面積檢測(cè)是否含有腺苷并分析不同提取條件下腺苷的含量，得出最佳提取條件。

2.4 解酒產(chǎn)品復(fù)配及其對(duì)醉酒小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.4.1 解酒產(chǎn)品復(fù)配液的制備

1）解酒產(chǎn)品成分：葛花提取液（2.1中制備）、擬青霉菌腺苷提取液（采用2.3中腺苷提取方法中的最佳提取條件處理菌液，高速離心過(guò)濾后收集上清液封口備用）、富里酸。

2）解酒產(chǎn)品復(fù)配

A液標(biāo)號(hào)：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶3∶3（體積比）

B液標(biāo)號(hào)：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶1∶5（體積比）

C液標(biāo)號(hào)：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比）

D液標(biāo)號(hào)：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶去離子水=1∶2∶4（體積比）

E液標(biāo)號(hào)：葛花提取液∶去離子水∶富里酸=1∶2∶4（體積比）F液標(biāo)號(hào)：葛花提取液∶去離子水=1∶6（體積比）復(fù)配條件：常溫，混合各組分后均勻攪拌即可。

2.4.2 解酒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用微波和超聲波協(xié)同提取葛花異黃酮類化合物，高速離心過(guò)濾后所得濾液為25 mL，已知冷凍干燥后的水溶物質(zhì)量為0.146 8 g，由此可得提取液中有效成分濃度為5.872 g/L；富里酸擬青霉菌采用微波和超聲波共同處理后，采用高效液相色譜儀檢測(cè)可知每0.01 mL擬青霉菌腺苷提取液中腺苷含量為0.004 mg，因此提取液中腺苷濃度為0.4 g/L；自制富里酸的濃度3 g/L。

由預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最適致醉量為0.15 mL乙醇/10 g體重。

將實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12小時(shí)后進(jìn)行解酒實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠從醉酒到醒酒時(shí)間內(nèi)的狀態(tài)并記錄醒酒時(shí)間。取小鼠70只，稱重標(biāo)記后隨機(jī)分為7組（分別為模型對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3、實(shí)驗(yàn)組4、實(shí)驗(yàn)組5、實(shí)驗(yàn)組6），每組10只。設(shè)計(jì)7種處理方案：

①模型對(duì)照組：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重生理鹽水；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

②實(shí)驗(yàn)組1：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重A液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

③實(shí)驗(yàn)組2：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重B液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

④實(shí)驗(yàn)組3：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重C液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

⑤實(shí)驗(yàn)組4：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重D液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

⑥實(shí)驗(yàn)組5：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重E液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

⑦實(shí)驗(yàn)組6：每只小鼠灌胃0.25 mL/10 g體重F液；10 min后灌胃0.15 mL/10 g體重白酒。

2.4.3 小鼠醉酒、醒酒判斷

以“翻正反射”實(shí)驗(yàn)判斷小鼠醉酒、醒酒狀態(tài)[20]。給小鼠灌酒后，將其背部向下放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，如果該姿勢(shì)保持30 s以上就認(rèn)為翻正反射消失，此時(shí)小鼠為醉酒狀態(tài)，反之小鼠未醉。給酒后一段時(shí)間，當(dāng)小鼠出現(xiàn)走路不穩(wěn)，站立也不穩(wěn)，尾巴拖地現(xiàn)象時(shí)，稱為拖尾現(xiàn)象。醉酒小鼠出現(xiàn)翻正反射消失的時(shí)間為醉酒耐受時(shí)間。灌酒后翻正反射消失到恢復(fù)的時(shí)間為醒酒時(shí)間。

3 結(jié)果與討論

3.1 葛花提取液中水溶物含量的分析

葛花粉與去離子水按固液比1∶15（g/mL）混合后，分別采用微波和超聲波共同提取、僅超聲提取、僅微波提取的方法進(jìn)行比較研究。3種方法提取結(jié)束后，將葛花提取液高速離心，取上清液（濾液）進(jìn)行冷凍干燥12 h，稱量干燥后的粉末質(zhì)量。

計(jì)算提取率。不同提取方法的提取液中水溶物含量如表1所示。

表1 葛花不同提取方法水溶物成分含量Table 1 Pueraria lobata flowers water soluble component content under different extraction methods

結(jié)果顯示，3種提取條件的提取率由高到低為：微波和超聲波>微波>超聲波，采用微波和超聲波協(xié)同提取方法所得水溶物含量最大，提取率可達(dá)7.34%，因此復(fù)配液中葛花提取液采用微波和超聲波協(xié)同提取法提取制備。

3.2 富里酸擬青霉菌中腺苷的檢測(cè)結(jié)果分析

將配置的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.0004、0.002、0.004、0.02、0.04、0.06 mg/mL 腺苷標(biāo)樣，按 2.3.2色譜條件進(jìn)樣0.01 mL，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光率為縱坐標(biāo)記錄色譜圖。圖1為0.004 mg/mL腺苷標(biāo)樣的色譜圖，根據(jù)不同濃度的譜圖可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 0.004 mg/mL腺苷標(biāo)樣色譜圖Fig.1 0.004 mg/mL adenosine sample chromatogram

采用微波和超聲波協(xié)同提取腺苷后，使用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，利用ESTD計(jì)算法，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)含有腺苷，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出當(dāng)進(jìn)樣0.01 mL時(shí)，腺苷含量為0.004 mg，色譜圖如圖2所示。

3.3 解酒復(fù)配液對(duì)小鼠解酒效果分析

3.3.1 各組復(fù)配液對(duì)小鼠醉酒率的結(jié)果比較

根據(jù)“翻正反射”實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷小鼠的醉酒、醒酒狀態(tài)，記錄各組小鼠醉酒只數(shù)，得出各組復(fù)配液對(duì)小鼠醉酒率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

圖2 微波和超聲波協(xié)同提取腺苷色譜圖Fig.2 Microwave and ultrasonic synergistic extraction of adenosine chromatogram

表2 各組復(fù)配液對(duì)小鼠醉酒率的影響Table 2 The effect of the compound solution on the intoxication rate

表3 各組復(fù)配液對(duì)小鼠醉酒、醒酒時(shí)間的影響Table 3 The effect of the compound solution on intoxication and decanting time of mice

續(xù)表3 各組復(fù)配液對(duì)小鼠醉酒、醒酒時(shí)間的影響Continue table 3 The effect of the compound solution on intoxication and decanting time of mice

參照2.4.1解酒產(chǎn)品復(fù)配液的制備及模型對(duì)照組的配比，由表2得到結(jié)果，可以說(shuō)明模型對(duì)照組用生理鹽水灌胃小鼠無(wú)防醉作用；實(shí)驗(yàn)組4～實(shí)驗(yàn)組6采用葛花提取液或與擬青霉菌腺苷提取液、富里酸單獨(dú)復(fù)配的防醉作用不明顯；實(shí)驗(yàn)組1～實(shí)驗(yàn)組3同時(shí)采用葛花提取液、擬青霉菌腺苷提取液和富里酸防醉作用明顯提高，說(shuō)明擬青霉菌腺苷和富里酸在小鼠防醉作用中起到了主要作用；實(shí)驗(yàn)組3與其余實(shí)驗(yàn)組相比，醉酒率最低，防醉效果最好；實(shí)驗(yàn)組3[葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比）]配比中擬青霉菌腺苷與富里酸對(duì)小鼠起到了協(xié)同增效的防醉作用。

3.3.2 各組復(fù)配液對(duì)小鼠醒酒結(jié)果的比較

記錄各組小鼠醉酒時(shí)間（拖尾時(shí)間）、醒酒時(shí)間，記錄小鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的狀態(tài)，記錄如表3所示。

結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組1～實(shí)驗(yàn)組6的醉酒時(shí)間（拖尾時(shí)間）均有所延長(zhǎng)，并且實(shí)驗(yàn)組3呈現(xiàn)顯著差異，而其余實(shí)驗(yàn)組差異不太顯著；醒酒時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組1～實(shí)驗(yàn)組6醒酒時(shí)間均有所減少，且實(shí)驗(yàn)組3差異明顯，由此可得出，復(fù)配液最佳配比為：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比）時(shí)，解酒效果最好。

3.4 最佳條件下復(fù)配液各成分含量分析

1）復(fù)配液最佳配比為：葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比），復(fù)配液中富里酸含量達(dá)到57.14%，擬青霉菌腺苷提取液占28.57%，葛花提取液占14.29%，該比例所配置的解酒產(chǎn)品解酒效果最佳。

2）采用微波和超聲波協(xié)同提取葛花有效成分，高速離心過(guò)濾后所得濾液為25 mL，冷凍干燥后的水溶物質(zhì)量為0.146 8 g，由此可得提取液中葛花有效成分含量為：0.005 872 g/mL；富里酸擬青霉菌采用微波和超聲波共同處理后，利用高效液相色譜儀檢測(cè)可知每0.01 mL擬青霉菌腺苷提取液中腺苷含量為0.004 mg，因此提取液中腺苷濃度為：0.000 4 g/mL。得出配置7 mL解酒產(chǎn)品各組分中有效成分的含量如表4。

表4 各組分有效成分含量Table 4 Effective component content for compound solution

由表4可知，除富里酸外，葛花水溶物有效成分含量較高，擬青霉菌腺苷含量較低，這些有效成分在解酒產(chǎn)品中起主要解酒功效。

4 結(jié)論

1）葛花水溶物采用微波和超聲波協(xié)同提取，提取率可達(dá)7.34%；將紅糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的富里酸擬青霉菌采用微波和超聲波協(xié)同提取，每0.01 mL試樣中含有腺苷量可達(dá)0.004 mg。

2）通過(guò)醉酒小鼠“翻正反射”實(shí)驗(yàn)得出葛花解酒產(chǎn)品復(fù)配液最佳配比為，葛花提取液∶擬青霉菌腺苷提取液∶富里酸=1∶2∶4（體積比），其中葛花提取液濃度為5.872 g/L，腺苷的濃度為0.4 g/L；自制富里酸的濃度3 g/L。實(shí)驗(yàn)證明該配比對(duì)醉酒小鼠有顯著的解酒作用，且除了葛花天然的解酒作用外，富里酸及擬青霉菌腺苷在解酒功效上有協(xié)同增效的作用；實(shí)驗(yàn)采用先給藥后給酒的灌胃方法，還在一定程度上體現(xiàn)出該配方產(chǎn)品有防醉功效，因此具有很好的市場(chǎng)價(jià)值。