（南陽理工學院生化學院，河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南南陽473004）

艾草（Artemisia argyi），又稱香艾，為菊科草本植物，適宜生長在溫帶地區(qū)，我國大部分地區(qū)均有生長，主要產(chǎn)于山東、安徽、河北、河南、湖北等省[1-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，艾草中含有的黃酮類化合物，具有降血脂、降血壓、抗血栓、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、延緩衰老以及治療慢性前列腺炎等多種生理活性。艾草作為黃酮類化合物的天然載體，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[6-13]。

AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附的因素與吸附率之間的關(guān)系具有非線性特征。利用反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可對非線性數(shù)據(jù)進行有效的分析處理，使非線性關(guān)系的輸入量與輸出量具有關(guān)聯(lián)性，但在實際應(yīng)用中存在網(wǎng)絡(luò)全局搜索能力不足、易陷入局部最優(yōu)等缺陷[14-17]。遺傳算法是一種概率搜索算法，它的基本思想是通過全面模擬自然選擇和遺傳機制，通過對種群個體的選擇、雜交和變異，形成一種具有“生產(chǎn)+檢驗”特征的搜索算法，該法具有全局最優(yōu)的特點，且能優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的連接權(quán)值，可很好地克服BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)陷入局部最優(yōu)的缺陷，從而對形式未知的函數(shù)求出最優(yōu)解[18-22]。

本文在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗的數(shù)據(jù)，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附過程的數(shù)學模型，利用遺傳算法對所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行全局尋優(yōu)，根據(jù)實際操作情況，將遺傳算法全局尋優(yōu)結(jié)果進行適當修正，確定AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附的最優(yōu)工藝，以期為艾草黃酮進一步的生理活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料

艾草：南陽市張仲景藥材市場，清洗，晾干，粉碎，備用。

1.2 試劑

蘆?。褐袊幤飞镏破窓z定所；氯仿、正丁醇、乙醇：天津科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機、101-2A電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA1004精密電子分析天平：上海天平儀器廠；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：無錫申科儀器有限公司；PHS-3C精密pH計、752N紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TDL-40B臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；300 mm×16 mm層析柱：上海摩速科學器材有限公司。

2 方法

2.1 艾草黃酮粗提液的制備

準確稱取20 g艾草粉置于1 000 mL三角瓶中，按照料液比1∶25（g/mL）的比例加入70%乙醇，置于60℃、120 r/min的恒溫水浴振蕩器內(nèi)恒溫振蕩2 h，抽濾，濾液進行真空濃縮，至沒有醇味。

2.2 Sevage法脫蛋白

量取適量艾草黃酮濃縮液于分液漏斗中，加入等體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇體積比為5∶1）劇烈振蕩20 min，靜置，去除蛋白層和有機溶劑層，取上清夜，反復多次操作，脫蛋白后的濃縮液置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 黃酮類化合物的測定

黃酮類化合物在亞硝酸鹽作用下，與Al（NO3）3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成黃色鋁絡(luò)合物，在堿性條件下顯紅色，507 nm波長下有最大吸收[23]，因此可采用NaNO2-Al（NO3）3顯色法，以蘆丁作為標準品制作標準曲線，以507 nm作為檢測波長測定吸光值，對比蘆丁標準曲線，計算黃酮含量。

2.4 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取經(jīng)105℃烘干的蘆丁標準品15 mg，用80%乙醇溶解，配制成0.15 mg/mL的蘆丁標準液100 mL，精密吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 的蘆丁標準液于7個潔凈的25mL容量瓶中，分別加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL 的 80%乙醇，然后再分別加入5%NaNO2溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，再分別加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，向每個容量瓶內(nèi)加入10%NaOH溶液10.0mL，最后用80%乙醇定容，充分振蕩后靜置15 min，在507 nm處測吸光值[24]。

2.5 單因素試驗

2.5.1 上柱液濃度對吸附率的影響

配制不同濃度的艾草黃酮上柱液100 mL，其濃度分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，pH5.0，以 0.8 mL/min的流速上柱進行動態(tài)吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達到泄露點時，停止上柱，計算吸附率。

2.5.2 上柱液流速對吸附率的影響

配制0.6 mg/mL的艾草黃酮上柱液100 mL，調(diào)節(jié)酸堿性使其 pH5.0，分別以 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL/min的流速上柱進行動態(tài)吸附，分步收集流出液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達到泄露點時，停止上柱，計算吸附率。

2.5.3 上柱液pH值對吸附率的影響

配制0.6 mg/mL艾草黃酮上柱液100 mL，分別調(diào)節(jié)pH 值為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，調(diào)節(jié)流速為 0.8 mL/min，收集流出的溶液（5 mL/管），以流出液的顏色為參考，上柱液達到泄露點時，停止上柱，計算吸附率。

2.6 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以上柱液濃度、流速、pH值3個因素為自變量，以吸附率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計[25-26]，因素水平表如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

2.7 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

隨機選擇Box-Behnken試驗設(shè)計的12組試驗數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學習及訓練樣本，其他3組試驗數(shù)據(jù)用來檢驗所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的泛化能力，根據(jù)Box-Behnken試驗的因素個數(shù)以及需要進行優(yōu)化的指標的個數(shù)，設(shè)計BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)[27]，選擇收斂精度10-3。

2.8 遺傳算法優(yōu)化

利用遺傳算法對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進行全局尋優(yōu)，以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值作為求解的目標函數(shù)值，以Box-Behnken試驗設(shè)計的數(shù)據(jù)作為初始種群，種群規(guī)模12，交叉概率0.05，變異概率0.01[28]。

2.9 吸附率的計算

式中：V0為上柱液體積，mL；C0為起始濃度，mg/mL；Vr為流出液體積，mL；Cr為過柱液濃度，mg/mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 蘆丁標準曲線的繪制結(jié)果

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

以蘆丁含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得一元線性回歸方程為：y=0.339 5x+0.007 8，R2=0.997 5

3.2 單因素試驗結(jié)果

3.2.1 上柱液濃度對吸附率的影響

上柱液濃度對吸附率的影響見圖2。

圖2 上柱液濃度對吸附率的影響Fig.2 The effect of upper column concentration on adsorption rate

由圖2可知，吸附率隨上柱液黃酮質(zhì)量濃度的增大而逐漸增大，當濃度大于1.0 mg/mL時吸附率出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于大孔樹脂的吸附能力是有限的，當樹脂吸附達到飽和狀態(tài)時，隨著上柱液濃度的增加吸附率變化不明顯[29]。

3.2.2 上柱液流速對吸附率的影響

上柱液流速對吸附率的影響見圖3。

圖3 上柱液流速對吸附率的影響Fig.3 The effect of flow velocity of upper column fluid on adsorption rate

由圖3可知，隨上柱液流速的增加，大孔樹脂對艾草黃酮的吸附率逐漸增大，當上柱液流速大于0.8 mg/mL時，上柱液流速越大，樹脂對黃酮的吸附率越低，可能是上柱液流速過大時，黃酮類化合物未被樹脂充分吸附[30]。

3.2.3 上柱液pH值對吸附率的影響

上柱液pH值對吸附率的影響見圖4。

圖4 上柱液pH值對吸附率的影響Fig.4 The effect of upper column pH on adsorption rate

由圖4可知，上柱液pH值對吸附率的影響較大，當上柱液pH值小于5.0時，吸附率相對較高，可能是黃酮類化合物含有酸性基團，在酸性條件下更易被大孔樹脂吸附，當pH>5.0時，隨pH值的增大，吸附率明顯下降[29]。

3.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

Box-Behnken試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果Table 2 The results of Box-Behnken experiment

圖5 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓練過程Fig.5 The training process of BP neural network

根據(jù)Box-Behnken試驗的結(jié)果，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附過程的數(shù)學模型，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學習及訓練過程如圖5所示。

由圖5可知，隨訓練次數(shù)增多，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓練誤差平方和逐漸減小，經(jīng)4 923次訓練，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂，收斂精度達10-3，說明所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型逼近能力較強[31]，可模擬AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附過程。

3.4 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果

利用遺傳算法對所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行全局尋優(yōu)，尋優(yōu)過程如圖6所示。

圖6 遺傳算法尋優(yōu)過程Fig.6 The optimizing computation process of genetic algorithm

經(jīng)過100代遺傳進化，遺傳算法全局尋優(yōu)的結(jié)果為：上柱液濃度1.190 1 mg/mL，流速0.407 6 mL/min，pH4.682 6；最佳的目標函數(shù)值即最優(yōu)適應(yīng)度（AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附率）為90.419 2%。為便于實際操作，將遺傳算法全局尋優(yōu)的結(jié)果適當修正為：上柱液濃度 1.2 mg/mL，流速 0.4 mL/min，pH4.68。

3.5 最優(yōu)提取工藝的驗證試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，并與遺傳算法全局尋優(yōu)修正后的結(jié)果相結(jié)合，確定AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附的最優(yōu)工藝為：上柱液濃度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。在此條件下進行3次驗證試驗，結(jié)果取平均值，在此條件下AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附率可達90.28%。4 結(jié)論

1）結(jié)合單因素試驗結(jié)果，利用Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)，采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附過程的數(shù)學模型，經(jīng)4 923次學習及迭代訓練，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型收斂，收斂精度達10-3，說明所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)逼近輸入與輸出特性的能力比較強，可將其應(yīng)用于AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附工藝的優(yōu)化。

2）利用遺傳算法對所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行全局尋優(yōu)，結(jié)合實際條件，將遺傳算法全局尋優(yōu)結(jié)果及單因素試驗結(jié)果相結(jié)合，確定AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附最優(yōu)工藝為：上柱液濃度1.2 mg/mL，流速0.4 mL/min，pH4.68。根據(jù)此條件進行3次驗證試驗，并取平均值，吸附率可達90.28%。

綜上，將單因素試驗、Box-Behnken試驗、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遺傳算法相結(jié)合優(yōu)化AB-8大孔樹脂對艾草黃酮動態(tài)吸附工藝是可行的，也為其他中藥材中黃酮類化合物的分離純化研究提供了有益參考。