李京蓉， ， ， ， ， ， ，， ， ， ，5，

(1. 青海師范大學(xué)， 青海 西寧810008； 2. 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810001； 3. 青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧810016；4. 天水師范學(xué)院甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 天水741000； 5. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京100049； 6. 青海省水文水資源勘測(cè)局，青海 西寧 810001 )

中國(guó)有廣袤的疆土和復(fù)雜的地形，干旱和半干旱地區(qū)主要集中在華北、東北和西北地區(qū)[1]。各地環(huán)境中都各具特色。當(dāng)植物遭遇不良環(huán)境(如高低溫、干旱、鹽),則發(fā)生一系列的生理生化代謝反應(yīng),表現(xiàn)為可逆抑制植物的代謝和生長(zhǎng),在嚴(yán)重的情況下甚至?xí)斐刹豢赏旎氐膫?導(dǎo)致整個(gè)植物的死亡, 給農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的生產(chǎn)帶來不可估量的損失[2]。

青海省位于青藏高原東北方向，天然草地資源十分豐富。而青海省內(nèi)幾乎無良好的飼料資源，優(yōu)質(zhì)的飼草供應(yīng)已成為制約該牧區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的障礙。一些地方采用了開發(fā)利用當(dāng)?shù)匾吧N質(zhì)資源的方法來解決這一矛盾，更多的是從外地或國(guó)外采購(gòu)的解決方案來滿足這種需求，但是引進(jìn)品種不適合在當(dāng)?shù)貝毫拥淖匀粭l件下耕作。若要長(zhǎng)期穩(wěn)定地解決種源問題，尋找高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)飼草種源以治理生態(tài)環(huán)境和改良退化草地已迫在眉睫[3-4]。

本試驗(yàn)選取的六種草種為多年生禾本科牧草。多生長(zhǎng)于海拔3000～3600m以上的天然草地，是很多地區(qū)草地改良和人工草地建設(shè)的優(yōu)良牧草，還是退耕還林、水土保持的重要牧草。然而，這些優(yōu)良牧草目前仍處于試驗(yàn)階段，還未大規(guī)模種植并應(yīng)用于草地恢復(fù)與畜牧業(yè)發(fā)展中。

研究表明，干旱脅迫會(huì)造成植物生理脫水，導(dǎo)致細(xì)胞和組織的水勢(shì)下降，從而影響植物的各項(xiàng)生理生化反應(yīng)過程[5]。同時(shí)，干旱脅迫還會(huì)破壞線粒體、葉綠體及其核結(jié)構(gòu)的功能，影響光合作用和呼吸作用[6]。此外，青海特殊的地理位置及氣候，容易發(fā)生春旱等干旱脅迫會(huì)影響種子萌發(fā)時(shí)的吸水量，造成萌發(fā)不穩(wěn)定，萌發(fā)率低，并且影響出苗率，嚴(yán)重時(shí)會(huì)完全抑制種子萌發(fā)[7-8]，也會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞膨壓降低，從而阻礙植物生長(zhǎng)[9]。

張美俊[10]、石永紅[11]等試驗(yàn)表明丙二醛(malondialdehyde, MDA) 、可溶性糖含量及葉綠素含量能夠作為評(píng)價(jià)植物抗旱性的指標(biāo)。因此，本試驗(yàn)通過探究這六種牧草在萌發(fā)期，主要是苗期對(duì)干旱的生理響應(yīng)，綜合評(píng)價(jià)它們的抗旱性強(qiáng)弱，為草甸恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取了在青海省分布較為廣泛的6種禾本科牧草進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)(見表1)。

表1 供試材料Table 1 Test materials

1.2 試驗(yàn)材料處理方法

1.2.1牧草萌發(fā)期試驗(yàn)材料處理方法 水分脅迫條件由聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)溶液產(chǎn)生。共設(shè)6種處理，即PEG 質(zhì)量濃度分別為0%(CK,蒸餾水)、5%、10%、15%、20%、25%。選擇成熟、飽滿、中等大小、均勻、無病的健康種子作為萌發(fā)材料。每粒試驗(yàn)種子用1% NaCl 消毒15分鐘，用蒸餾水清洗干凈并放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量的PEG溶液，使其發(fā)芽。培養(yǎng)皿放置在培養(yǎng)箱中,溫度控制在20℃左右,每天大約12 h光照。每天給培養(yǎng)皿加等量的 PEG 溶液，濾紙浸透，少許剩余，每4天更換一次濾紙，以減少水勢(shì)變化。對(duì)照(CK)以蒸餾水代替 PEG 。每個(gè)濃度梯度4個(gè)重復(fù)(包括對(duì)照)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。從觀察的日期起，從種子置于培養(yǎng)皿開始，胚芽長(zhǎng)度為種子長(zhǎng)度的1/2作為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。將重復(fù)中最早有一粒發(fā)芽的日期作為開始，之后每天記錄發(fā)芽種子的數(shù)量，當(dāng)連續(xù)12天每個(gè)培養(yǎng)皿都不再有種子萌發(fā)時(shí)將其作為發(fā)芽的結(jié)束期[12-14]。

發(fā)芽率(%) =(發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.2.2牧草苗期試驗(yàn)材料處理方法 選擇土壤需篩分除石去雜質(zhì)，土壤:細(xì)砂:生物肥料的比例為4:1:1，入盆澆透，然后用1%NaCl 消毒的種子均勻地撒在盆中，播種深度1 cm，再輕輕的用干土覆蓋。播種后，將花盆放置在露天的室外環(huán)境中(避免雨水)，直到幼苗長(zhǎng)到2～3片葉時(shí)開始間苗，每盆留30株。每種牧草6盆，共計(jì)36盆。生長(zhǎng)到4～5片葉片時(shí)進(jìn)行處理。設(shè)置干旱脅迫處理和對(duì)照(正常澆水)兩組。所有材料都是實(shí)驗(yàn)前3 d澆水以使每盆土壤處于飽和含水狀態(tài)與正常澆水(土壤含水量保持在22.78±2.01%)作為對(duì)照。樣品分別于第0 d、第4 d、第8 d、第12 d和第16 d早上7:00-8:30 am(8:30-9:00 am)采樣，選用長(zhǎng)勢(shì)一致、外觀大小相似的葉片，樣品用塑料包裝后，用保鮮膜包裹置于實(shí)驗(yàn)室的冰箱中，并及時(shí)測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1相對(duì)含水量 取樣稱重后立即浸入水中后數(shù)小時(shí)，吸干水分，立即稱重；再次浸泡在水中一段時(shí)間，吸干水分，然后稱重，直到兩次稱重的結(jié)果基本一致，即新鮮的葉重(Wt)，放在烘箱中烘干至恒重，稱干重(Wd)。按下式計(jì)算：

葉片相對(duì)含水量(%)= 100%×[(Wf-Wd)/(Wt-Wd)]

1.3.2MDA含量和可溶性糖含量 MDA 含量和可溶性糖含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA) 比色法測(cè)定，采用雙組分分光光度計(jì)法可同時(shí)測(cè)定出可溶性糖的含量[15]。取上述酶提取液1.5 ml，加入2.5 ml 0.6%的TBA 溶液，混勻于沸水浴中反應(yīng)15 min，迅速冷卻后4℃下離心10 min，取上清液測(cè)定450、532和600 nm下的吸光度[16]。

1.3.3葉綠素相對(duì)含量 稱取剪碎的鮮樣，于研缽中研成勻漿，加80%丙酮，繼續(xù)磨至組織變白，再過濾至25 ml容量瓶中，反復(fù)用丙酮清洗數(shù)次，最后用丙酮定容至25 ml。以80%丙酮為空白對(duì)照，測(cè)定470 nm、646 nm、663 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

Ca=12.21D663-2.81D646；

Cb=20.13D646-5.03D663；

葉綠素總濃度C=Ca+Cb；

Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229；

Ca、Cb，葉綠素a和葉綠素b的濃度；Cx.c，類胡蘿卜素的總濃度。

根據(jù)下式計(jì)算組織中各色素的含量：

色素含量(mg/g)=[色素濃度C(mg/ml)×提取液總量(ml)×稀釋倍數(shù)×1000]/樣品葉片鮮重(g)。

1.4 綜合評(píng)價(jià)方法

應(yīng)用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法[17-20]進(jìn)行綜合評(píng)判，其計(jì)算公式如下:

(1) 與抗旱性呈正相關(guān)的參數(shù)采用公式:

U(Xijk)=Xijk-Xmin/Xmax-Xmin

(2) 與抗旱性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)采用公式:

U(Xijk)=1-Xijk-Xmin/Xmax-Xmin

式中，U( Xijk ) 為第i 個(gè)草種第j 個(gè)干旱天數(shù)第k 項(xiàng)指標(biāo)的隸屬度，且U( Xijk )∈[0，1]; Xijk表示第i個(gè)草種第j個(gè)干旱天數(shù)第k個(gè)指標(biāo)測(cè)定值; Xmax、Xmin為所有參試種中第k 項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007、SPSS 20.0 分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)和Orgin 程序繪圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理了相同物種和不同 PEG 濃度間以及相同 PEG 濃度下不同物種之間的差異，用 SNK 方法在0.05顯著水平上做多重比較[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG對(duì)禾本科牧草萌發(fā)期抗旱性影響

從圖1可以看出，種子萌發(fā)后對(duì)水分脅迫具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。用不同濃度的PEG溶液處理試驗(yàn)種子，當(dāng) PEG 濃度低(5% PEG) 時(shí)，有效促進(jìn)種子萌發(fā)，6種牧草發(fā)芽率相比對(duì)照均有所增加；另外，除在0%和10%PEG 濃度時(shí)各品種發(fā)芽率相近外，15%～25% PEG 濃度下的6種禾本科牧草種子的發(fā)芽率隨 PEG 濃度的增加呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.05)。由圖可知，6種牧草發(fā)芽率大小順序?yàn)椋翰菰贷溎?無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

圖1 不同PEG濃度處理下發(fā)芽率Fig.1 Relative germination rate of six grasses under different PEG concentrations treatment注：小寫字母表示同一物種濃度間差異，大寫字母表示同一濃度下物種間差異Note: Lowercase letters indicate difference in concentrations of the same species, and capital letters indicate difference between species at the same concentration

2.2 干旱脅迫對(duì)禾本科牧草苗期各生理指標(biāo)影響

圖2可知，各牧草葉片相對(duì)含水量與對(duì)照(土壤含水量保持在22.78±2.01%)相比變化不大，而各牧草相對(duì)含水量均隨干旱天數(shù)增加而呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。不同牧草間比較，對(duì)照、4 d與8 d時(shí)，各品種相對(duì)含水量變化不大，但第12 d、16 d時(shí)，各品種間相對(duì)含水量存在顯著差異，下降速度依次是大穎草>扁穗冰草>同德貧花鵝觀草>同德短芒披堿草>草原看麥娘>無芒雀麥。

圖2 干旱脅迫對(duì)相對(duì)含水量的影響Fig.2 Effect of Drought Stress on Relative Water Content

圖3 干旱脅迫對(duì)丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of Drought Stress on Malondialdehyde Content

由圖3可知，丙二醛含量隨干旱脅迫程度的增強(qiáng)而呈整體上升趨勢(shì)。在12 d和16 d，大穎草、扁穗冰草 MDA 增加最多，分別比對(duì)照增加了9.14，12.31倍和9.31，12.78倍；MDA 增加最少的為草原看麥娘和無芒雀麥，分別為對(duì)照的5.84，8.77倍和5.71，8.52倍；同德短芒披堿草和同德貧花鵝觀草的增量則居中，分別是對(duì)照的7.84，11.82倍和8.39，12.14倍。表明大穎草、扁穗冰草受害最大，草原看麥娘、無芒雀麥?zhǔn)芎t最小。

可溶性糖含量在圖4中呈先升高后降低的趨勢(shì)。在8 d時(shí)，可溶性糖含量最高，并自此開始下降。其中，大穎草、扁穗冰草分別比對(duì)照下降了1.53和2.82倍，相比其他物種可溶性糖含有量最少，抗旱能力相對(duì)其他牧草較弱。

圖4 干旱脅迫對(duì)可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of Drought Stress on Soluble Sugar Content

葉綠素含量由圖5可知，在第0～4 d，各牧草葉綠素均呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)(P<0.05)，但從第8～16 d開始，各牧草葉綠素含量隨干旱天數(shù)的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且各品種間存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 干旱脅迫對(duì)葉綠素含量的影響Fig.5 Effects of Drought Stress on Chlorophyll Content注：小寫字母表示同一物種濃度間差異，大寫字母表示同一濃度下物種間差異Note: Lowercase letters indicate difference in concentrations of the same species, and capital letters indicate difference between species at the same concentration

2.3 禾本科牧草抗旱性綜合評(píng)價(jià)

將參試的6種牧草與各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，計(jì)算6種牧草各指標(biāo)隸屬度值，并以各牧草的平均抗旱隸屬度作為鑒定抗旱性強(qiáng)弱的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)6種牧草的抗旱性指標(biāo)隸屬函數(shù)值及抗旱能力大小(表2)，六種牧草的隸屬函數(shù)值平均數(shù)大小依次為：草原看麥娘>無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

表2 各牧草對(duì)干旱脅迫適應(yīng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及評(píng)價(jià)Table 2 Membership value and evaluation of adaptation indexes of herbage to drought stress

3 討論

抗旱性是受多種因素影響的一種復(fù)雜的定量性狀。一個(gè)物種在所有性狀上都不會(huì)特別顯著。因此，孤立的用單一指標(biāo)評(píng)定牧草的抗旱性是片面的，得出的結(jié)果可能并不能準(zhǔn)確的代表牧草的實(shí)際抗旱能力。因此，為了反映植物抗旱性，在評(píng)價(jià)植物抗旱時(shí)，應(yīng)利用多種指標(biāo)對(duì)牧草抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并結(jié)合實(shí)際生長(zhǎng)情況進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。此外，牧草干旱脅迫下的抗旱性機(jī)制及其改善方法還有待進(jìn)一步研究[21-23]，以取得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

水分是種子萌發(fā)的必要條件之一?？购敌詮?qiáng)的牧草具有較高的萌發(fā)率以及抗旱性弱的牧草具有較低的萌發(fā)率。而Blum[24]與Sharma[25]認(rèn)為，水分脅迫下植物種子的萌發(fā)率和抗旱性并不是呈正相關(guān)關(guān)系，甚至是負(fù)相關(guān)的。在研究牧草種子萌發(fā)特性及其抗旱性差異時(shí)，不同濃度的PEG溶液一般被用作滲透脅迫因子，模擬土壤自然水勢(shì)，在水分脅迫下對(duì)牧草種子萌發(fā)進(jìn)行處理。目前，關(guān)于豆科植物的研究較多[22,26-27]和Agropyron vristatum[5,28]。結(jié)果表明，PEG脅迫下種子萌發(fā)率可以作為這些牧草抗旱性能的評(píng)定指標(biāo)。本研究對(duì)六種禾本科牧草發(fā)芽率的結(jié)果分析與前面的研究保持一致。

葉綠素是一種植物合成有機(jī)色素、進(jìn)行光合作用的物質(zhì)，外部的環(huán)境情況會(huì)影響它的合成與降解，以此反映牧草對(duì)外界脅迫的應(yīng)對(duì)能力。干旱脅迫情況下，葉綠素含量在初始的前幾天有所升高，之后會(huì)逐漸降低。有研究表明抗旱性強(qiáng)的牧草的葉綠素含量高于抗旱性弱的牧草的葉綠素含量[29-31]。其原因可能是由于葉綠素生物合成作用減弱引起的水分的急劇減少；另一方面，由于干旱引起植物中活性氧的積累，氧自由基的積累直接或間接活化膜脂質(zhì)過氧化，造成膜滲透性損傷，加速葉綠素分解[30]。結(jié)果表明，在干旱脅迫下6種禾本科草葉綠素的變化趨勢(shì)與黃華等[32]、張曉海等[33]的結(jié)果一致,在第0～4 d，各牧草葉綠素均呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，而從第8～16 d開始，各牧草葉綠素含量隨干旱天數(shù)的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且各品種間存在顯著差異。本試驗(yàn)中葉綠素含量的大小順序?yàn)?草原看麥娘>無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

干旱脅迫下植株體表首先體現(xiàn)出植株慢慢發(fā)黃，體內(nèi)表現(xiàn)為葉片含水量下降。試驗(yàn)表明，干旱脅迫下6種禾本科牧草葉片相對(duì)含水量均隨干旱脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)而呈顯著下降趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果一致[27,34-35]。所得出相對(duì)含水量的大小順序依次是：草原看麥娘>無芒雀麥>同德貧花鵝觀草>同德短芒披堿草>大穎草>扁穗冰草。

干旱脅迫使牧草生物膜的結(jié)構(gòu)和功能受到一定程度的損害，隨著干旱時(shí)間的增長(zhǎng)，生物膜所受損害程度逐漸加深，影響植物體內(nèi)一系列的生理生化代謝反應(yīng)?？购敌詮?qiáng)弱的指標(biāo)MDA是細(xì)胞膜過氧化的終產(chǎn)物，丙二醛含量一般情況下可代表細(xì)胞膜的傷害程度[36]。結(jié)果表明，隨著水分脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，丙二醛含量在12～16 d期間顯著增加，研究結(jié)果與辛國(guó)榮等[37-38]的結(jié)果一致，但也有人[39]認(rèn)為抗旱性強(qiáng)的品種的MDA含量相較于不抗旱品種反而增加較多。這種現(xiàn)象可能是在干旱脅迫下不同品種的丙二醛對(duì)此脅迫的敏感度存在差異，因此導(dǎo)致調(diào)節(jié)程度的不同。本試驗(yàn)中丙二醛含量的大小順序是：無芒雀麥>草原看麥娘>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。

在干旱脅迫下，一些可溶性物質(zhì)在植物體內(nèi)會(huì)自發(fā)的迅速積累，以降低其體內(nèi)滲透潛力，從而保證干旱脅迫下植物的正常供水量。其中，可溶性糖是植物體細(xì)胞內(nèi)的主要滲透調(diào)節(jié)物，可溶性糖含量的多少直接體現(xiàn)出細(xì)胞受到的干旱脅迫強(qiáng)度，也可判定植物對(duì)逆境脅迫的抵抗力[40-41]。試驗(yàn)表明，6種禾本科牧草在第8 d前可溶性糖迅速積累，當(dāng)干旱脅迫持續(xù)到12 d時(shí)，各禾本科牧草的可溶性糖含量都有所降低，但相較于對(duì)照仍呈上升趨勢(shì)，直到16 d時(shí)，與對(duì)照沒有顯著的差異。

本研究以6種高寒地區(qū)的禾本科牧草為研究對(duì)象，選擇種子萌發(fā)期和幼苗期兩個(gè)對(duì)水分最為敏感的時(shí)期進(jìn)行了抗旱性試驗(yàn)并測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)。試驗(yàn)通過人工模擬牧草的逆境生長(zhǎng)環(huán)境，但這與牧草的實(shí)際生長(zhǎng)逆境條件仍存在很大差別。因此，取得的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還有待于到實(shí)踐中去檢驗(yàn)。本試驗(yàn)僅對(duì)幼苗的抗旱性能做了研究,對(duì)干旱脅迫下6種禾本科牧草的水分臨界期以及其他指標(biāo)的影響還有待于進(jìn)一步研究。以后的研究如果能與實(shí)際環(huán)境條件和生產(chǎn)實(shí)際相結(jié)合，使篩選出的抗旱性強(qiáng)的高寒草甸優(yōu)良牧草服務(wù)于實(shí)際生產(chǎn)需要并有效促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)論

本文選擇了六種禾本科牧草，進(jìn)行種子萌發(fā)期以及幼苗期抗旱性研究?？芍?，從種子萌發(fā)期抗旱性結(jié)果表明，PEG 濃度在5%時(shí)促進(jìn)種子萌發(fā)，較高PEG 濃度(15%～25%)顯著抑制種子發(fā)芽率。通過對(duì)萌發(fā)期發(fā)芽率和苗期各生理指標(biāo)進(jìn)行隸屬綜合值評(píng)價(jià)得出，6種牧草抗旱性強(qiáng)弱為：草原看麥娘>無芒雀麥>同德短芒披堿草>同德貧花鵝觀草>大穎草>扁穗冰草。