王 敏

人參是最重要的中藥材之一，有多種藥理作用，在臨床中應(yīng)用廣泛。人參的主要生物學(xué)活性依賴于人參皂苷，人參皂苷屬于三萜皂苷，具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管舒張、對(duì)部分腫瘤的抗癌活性等[1-5]。人參皂苷有多種活性成分，包括Rh1、Rh2、Rg1、Rg3和其他成分等。既往研究顯示，人參皂苷分子糖基數(shù)目越少，其抗腫瘤活性越好[6-7]。人參皂苷Rh2對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有顯著的增殖抑制活性，但是其作用機(jī)制尚未明確[7-8]。此外，人參皂苷Rh2對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療效應(yīng)及其分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究中探討了人參皂苷Rh2對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的抑制活性及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC1A，購于ATCC；采用DMEM培養(yǎng)液，補(bǔ)加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞抑制率 使用96孔板按3000個(gè)/孔接種HEC1A細(xì)胞，孵育24 h，待細(xì)胞貼壁生長。按照相應(yīng)設(shè)計(jì)濃度加入含人參皂苷Rh2的培養(yǎng)基，孵育相應(yīng)時(shí)間后，更換100 μl培養(yǎng)基（含10 μl CCK-8 溶液），孵育 30 min，酶標(biāo)儀（Immunoskan340型，英國BDSL公司）檢測(cè)450 nm處光密度D值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 相等數(shù)量細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)皿中，待生長融合至40%～50%時(shí)，更換含不同濃度人參皂苷Rh2的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24或48 h。收集全部細(xì)胞（含懸浮細(xì)胞），再重懸為100 μl細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC和PI染液，室溫避光反應(yīng)15 min，補(bǔ)充400 μl PBS后，使用流式細(xì)胞儀（FC500Mcl型，美國Beckman Coulter公司）檢測(cè)凋亡細(xì)胞率。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集相應(yīng)處理的HEC1A細(xì)胞，加入PIPA裂解液，置于冰上震蕩裂解30 min，12 000 r/min離心30 min，收集蛋白上清。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。使用聚丙烯酰氨凝膠電泳上樣緩沖液混勻蛋白樣品，沸煮 10 min保存蛋白樣本。采用SDS-PAGE、濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)膜硝酸纖維素濾膜，使用5%的脫脂奶粉TBST緩沖液室溫下脫色搖床上封閉1 h。加入cleaved PARP和caspase-3單克隆抗體(美國 Cell SignalingTechnology公司)4℃孵育過夜，加入1:2000辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(美國Pierce公司)室溫孵育1 h。最后，采用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rh2對(duì)HEC1A細(xì)胞增殖的影響CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，隨人參皂苷Rh2濃度升高，HEC1A細(xì)胞增殖的抑制效果顯著增強(qiáng)；采用同一濃度人參皂苷Rh2處理時(shí)，HEC1A細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)隨處理時(shí)間延長而增強(qiáng)。提示人參皂苷Rh2可以顯著抑制HEC1A細(xì)胞增殖，其抑制效果呈現(xiàn)顯著的濃度-時(shí)間依賴性（表1）。

表1不同濃度人參皂苷Rh2對(duì)HEC1A細(xì)胞增殖的抑制率（%）

2.2 人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HEC1A細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，用20 μM或40 μM人參皂苷Rh2分別處理HEC1A細(xì)胞24 h或48 h，結(jié)果顯示，處理48 h誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01，圖1、2)，提示人參皂苷Rh2誘導(dǎo)HEC1A細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。但是，兩濃度人參皂苷Rh2處理24或48 h之間比較，HEC1A細(xì)胞凋亡率無顯著差異（P>0.05）。

2.3 人參皂苷Rh2對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著人參皂苷Rh2處理時(shí)間延長，激活性的PARP和caspase-3蛋白水平顯著升高（圖3），提示人參皂苷Rh2通過增強(qiáng)caspase-3和PARP的活化，誘導(dǎo)HEC1A細(xì)胞的凋亡。但是，兩濃度人參皂苷Rh2處理24或48 h之間比較，caspase-3和PARP蛋白水平無顯著差異（P>0.05）。

圖3 不同濃度和時(shí)間人參皂苷Rh2對(duì)HEC-1A細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度人參皂苷Rh2處理HEC1A細(xì)胞的各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡率

3 討論

本研究結(jié)果表明，人參皂苷Rh2可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)出顯著的時(shí)間依賴性和一定水平的劑量依賴性。其作用機(jī)制可能是，人參皂苷Rh2通過增強(qiáng)caspase-3和PARP活化，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。

作為人參皂苷主要抗腫瘤活性成分，Rh2對(duì)多種腫瘤具有顯著的增殖抑制作用。相比有兩個(gè)糖基的其他人參皂苷成分，僅有一個(gè)糖基的Rh2顯示出更強(qiáng)的促凋亡活性[6]。既往研究顯示，Rh2通過調(diào)控細(xì)胞自噬、β-catenin信號(hào)通路、抑制MMP13，進(jìn)而抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖速度[9-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2抑制子宮內(nèi)膜癌增殖活性，與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡存在顯著相關(guān)性。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡。在凋亡相關(guān)細(xì)胞通路激活后，半胱天冬酶（caspases）裂解活化[12]。凋亡細(xì)胞通常呈現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小、變形[13]，其過程涉及一系列分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括形態(tài)學(xué)改變、染色質(zhì)凝聚和DNA碎裂等[14]。細(xì)胞凋亡的異常調(diào)控可導(dǎo)致多種疾病，包括惡性腫瘤。因此，靶向細(xì)胞凋亡機(jī)制是腫瘤治療的重要策略[15]。

caspase活化受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控。caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一個(gè)關(guān)鍵步驟，可分為兩個(gè)亞群：上游起始半胱天冬酶和下游效應(yīng)半胱天冬酶，直接與終末凋亡過程相關(guān)[16]。caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡過程中，其核心成分是凋亡蛋白酶激活因子（apaf-1）復(fù)合物的形成和Bcl-2家族異二聚體蛋白的形成[17]，調(diào)控半胱天冬酶的激活[18]。bcl-2相關(guān)蛋白按照功能分為兩組：抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白。細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞色素C的細(xì)胞質(zhì)易位促使apaf-1復(fù)合體的形成，激活caspase-9，然后激活其他半胱天冬酶[19]。最終，半胱天冬酶裂解活化發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。多聚ADP核糖聚合酶（PARP）是半胱天冬酶的底物，在細(xì)胞凋亡過程中裂解成為蛋白片段[20]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rh2誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，與casepase-3和PARP活化相關(guān)，這可能是人參皂苷Rh2抗腫瘤活性的重要機(jī)制之一。

總之，人參皂苷Rh2可以顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的體外增殖，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。人參皂苷Rh2是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的天然化合物，是一種很有前途的天然抗癌藥物，值得進(jìn)一步臨床研究。