帥云飛 謝 靜 李 鑫 荀春錚 麻玲霞 饒 慧

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007)

熱性驚厥(Febrile seizure，F(xiàn)S)是好發(fā)于6個(gè)月～5歲兒童的臨床常見(jiàn)驚厥性疾病，反復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間發(fā)作的FS可以造成腦損傷[1]。FS患病率高達(dá)3%～5%，復(fù)發(fā)率約為30%～40%。FS發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，研究認(rèn)為與免疫炎癥過(guò)程、細(xì)胞因子激活及遺傳因素相互作用密切相關(guān)[2]。研究表明，內(nèi)源性致熱因子TNF-α、IL-1β介導(dǎo)COX2、PGE2等炎癥因子大量表達(dá)從而引起機(jī)體發(fā)熱[2-6]，而發(fā)熱引起下丘腦及海馬等腦區(qū)神經(jīng)元興奮，形成異位放電從而導(dǎo)致FS發(fā)生[7，8]。TNF-α、IL-1β等促炎性細(xì)胞因子也可促進(jìn)神經(jīng)元興奮性增加，從而促進(jìn)Glu、Asp等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)大量表達(dá)，介導(dǎo)“神經(jīng)毒”導(dǎo)致FS腦損傷[9]。

羚羊角、鉤藤均具有“息風(fēng)止痙”之功效，臨床單用治療FS具有一定療效，但其作用強(qiáng)度較弱[10，11]。臨床治療FS時(shí)，羚羊角與鉤藤也常配伍使用[12]，即中藥七情配伍理論之“相須”為用，以羚羊角與鉤藤為君藥的羚角鉤藤湯治療FS臨床療效顯著[13]。然而，羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥的藥效作用與羚羊角及鉤藤單用是否異同，其作用環(huán)節(jié)是否異同？前期研究明確了羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥的最佳劑量，并發(fā)現(xiàn)最佳劑量較羚羊角及鉤藤單用顯著增加驚厥潛伏時(shí)間，抑制驚厥持續(xù)時(shí)間。本研究基于促炎性因子TNF-α及IL-1β及介導(dǎo)神經(jīng)毒的Glu、Asp探求其作用環(huán)節(jié)的異同，以期為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，21日齡，雌雄各半，體質(zhì)量(50±10)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004，合格證號(hào)：43004700024978。

1.1.2受試藥物 羚羊角(批號(hào)：20160912)、鉤藤(批號(hào)：20160909)均采用三九配方顆粒，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。

1.1.3儀器及試劑 HH-W420數(shù)顯恒溫水浴箱(金壇市科析儀器有限公司)，手持式勻漿器(德國(guó)IKA公司)，高速冷凍離心機(jī)(5180R，德國(guó)Eppendorf公司)，酶標(biāo)儀(iMARK，美國(guó)Bio-Rad 公司)，奧林巴斯BH-2 光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus)，數(shù)字?jǐn)z像儀TK-C1381(日本Vietor公司)，圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)研制)。Glu檢測(cè)試劑盒、Asp檢測(cè)試劑盒(上海優(yōu)予生物科技有限公司，批號(hào)：20160928)，TNF-α檢測(cè)試劑盒、IL-1β檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：20161015)。

1.2方法

1.2.1熱性驚厥大鼠模型的建立及處理 采用熱水浴建立FS大鼠模型[14，15]，取SD大鼠，置于(44.5±0.5)℃恒溫水浴箱，水深以大鼠僅露出頭部為宜，熱水浴時(shí)間為5 min。5 min內(nèi)出現(xiàn)驚厥者，納入實(shí)驗(yàn)，未驚厥者，剔除。隨機(jī)抽取10只鼠作為空白對(duì)照組，其余45只鼠進(jìn)行篩選，共有40只鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組，成模率88.89%。取符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為模型組、羚羊角組(0.405 g/kg)、鉤藤組(0.81 g/kg)、羚羊角(0.405 g/kg)與鉤藤(0.81 g/kg)聯(lián)合用藥組，每組10只。各藥物組大鼠，按10 ml/kg給予相應(yīng)藥液，1次/d，連續(xù)21 d。末次給藥24 h后，置于(44.5±0.5)℃恒溫水浴箱中，造模，隔日一次，連續(xù)10次。

1.2.2羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥對(duì)海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)影響 末次給藥24 h后，安樂(lè)處死各組大鼠，冰上取腦組織，采用HE法觀察羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥對(duì)熱性驚厥大鼠海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)改變情況。

1.2.3羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥對(duì)大鼠腦組織Glu、Asp、TNF-α及IL-1β含量影響 安樂(lè)處死大鼠，冰上取腦組織，4℃、3 000 r/min、15 min勻漿，取上清液，按ELISA法檢測(cè)大鼠Glu、Asp、TNF-α及IL-1β含量。

1.2.4羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥對(duì)大鼠海馬區(qū)TNF-α、IL-1β表達(dá)影響 安樂(lè)處死大鼠，冰上取腦組織，多聚甲醛固定，采用免疫組化法檢測(cè)海馬區(qū)TNF-α、IL-1β表達(dá)情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照，并進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1對(duì)FS大鼠海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)影響 模型組部分神經(jīng)細(xì)胞腫脹、脫失，海馬帶寬窄不一，CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目減少，排列紊亂，細(xì)胞極向差；細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞膜皺縮，呈不規(guī)則形、三角形；細(xì)胞核不規(guī)則，空泡變性。羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組細(xì)胞形態(tài)、大小基本正常，胞體邊界較清晰；細(xì)胞漿染色深淺基本均勻，胞核呈大致橢圓形、圓形，且清晰；神經(jīng)纖維輪廓及排列清晰；海馬帶整齊；位于CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞排列基本緊密、整齊，且層次清晰、細(xì)胞極性好。羚羊角組與鉤藤組海馬形態(tài)變化大致相同。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2對(duì)FS大鼠Asp和Glu含量影響 研究結(jié)果顯示，羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組、羚羊角組及鉤藤組Asp、Glu含量均較模型組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組Asp較鉤藤組顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3對(duì)FS大鼠腦組織TNF-α及IL-1β含量影響 研究結(jié)果表明，羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組、羚羊角組及鉤藤組TNF-α及IL-1β含量均較模型組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組TNF-α及IL-1β較鉤藤組顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4對(duì)FS大鼠海馬區(qū)TNF-α和IL-1β表達(dá)影響 研究結(jié)果顯示，羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組、羚羊角組及鉤藤組海馬區(qū)TNF-α、IL-1β表達(dá)量均較模型組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組海馬區(qū)TNF-α較羚羊角組、鉤藤組顯著降低(P<0.05)；羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥組海馬區(qū)IL-1β較鉤藤組表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3，圖2、3。

圖1 羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥對(duì)熱性驚厥大鼠的海馬組織病理學(xué)檢查(×400)Fig.1 Histopathological examination of hippocampus in hyperthermia rats with antelope horn and uncaria combined(× 400)Note:A.Blank group；B.Model group；C.Uncaria group；D.Antelope horn group；E.Antelope horns and uncaria group.

GroupsAsp(ng/ml)Glu(ng/ml)Control group10.37±1.172)19.31±0.972)Model group12.58±0.0322.52±1.00Antelope horn group11.41±1.011)21.04±1.171)Uncaria group11.54±0.811)3)21.02±1.641)Antelope horns and uncaria group10.54±0.632)20.32±0.962)

Note：Vs model group，1)P<0.05，2)P<0.01；vs antelope horns and uncaria group，3)P<0.05.

GroupsTNF-α(ng/ml)IL-1β(ng/ml)Control group18.31±2.752)15.74±2.482)Model group24.87±3.0022.58±3.24Antelope horn group21.86±1.662)19.72±2.622)Uncaria group20.62±2.391)3)18.62±1.611)3)Antelope horns and uncaria group18.60±1.862)16.17±2.362)

Note：Vs model group，1)P<0.05，2)P<0.01；vs antelope horns and uncaria group，3)P<0.05.

GroupsTNF-αIL-1βControl group0.30±0.082)0.30±0.052)Model group0.61±0.110.63±0.10Antelope horn group0.46±0.112)3)0.43±0.091)Uncaria group0.50±0.111)3)0.53±0.071)3)Antelope horns and uncaria group0.35±0.091)0.36±0.092)

Note：Vs model group，1)P<0.05，2)P<0.01；vs antelope horns and uncaria group，3)P<0.05.

圖2 羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥對(duì)熱性驚厥大鼠的海馬組織TNF-α的影響(×400)Fig.2 Effect of antelope horn and uncaria combined on expression of TNF-α in hippocampus of rats with febrile seizures(×400)Note:A.Control group；B.Model group；C.Uncaria group；D.Antelope horn group；E.Antelope horns and uncaria group.

圖3 羚羊角與鉤藤聯(lián)合用藥對(duì)熱性驚厥大鼠的海馬組織IL-1β的影響(×400)Fig.3 Effect of antelope horn and uncariae on expression of IL-1β in hippocampus of rats with febrile seizures(×400)Note:A.Control group；B.Model group；C.Uncaria group；D.Antelope horn group；E.Antelope horns and uncaria group.

3 討論

FS是小兒時(shí)期最常見(jiàn)的驚厥發(fā)作性疾病，也是小兒常見(jiàn)急癥。FS病因尚未完全明確，多以突發(fā)性的全身或者局限性肌群強(qiáng)制性、陣攣性收縮，并伴有意識(shí)障礙為主要臨床特征[16]。FS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫炎癥過(guò)程、細(xì)胞因子激活與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。

FS屬中醫(yī)學(xué)“急驚風(fēng)”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，外風(fēng)挾外邪侵襲人體，外風(fēng)感召、引動(dòng)內(nèi)風(fēng)，加上平素內(nèi)火旺，風(fēng)動(dòng)助火，風(fēng)火相煽，從而出現(xiàn)肝經(jīng)熱盛，熱極動(dòng)風(fēng)，發(fā)為急驚風(fēng)，臨床常用羚羊角、鉤藤等息風(fēng)止痙藥治療。有研究表明，羚羊角、鉤藤單用治療FS具有一定療效，但其作用強(qiáng)度較弱[10，11]。羚羊角與鉤藤也常配伍使用[12，13]，即中藥七情配伍理論之“相須”為用。中藥七情配伍理論認(rèn)為，相須是指性能功效相類(lèi)似藥物配伍應(yīng)用，可增加其原有療效，即產(chǎn)生藥效學(xué)的協(xié)同增效作用[17]。

研究表明，TNF-α、IL-1β是介導(dǎo)FS的關(guān)鍵促炎性細(xì)胞因子[2-6]。TNF-α、IL-1β介導(dǎo)PGE2、IL-6、ICAM-1等炎癥介質(zhì)大量釋放，從而引起機(jī)體發(fā)熱，而發(fā)熱又引起下丘腦及海馬等腦區(qū)神經(jīng)元興奮性增高，形成異位放電從而導(dǎo)致FS發(fā)生[2-6]。研究表明，F(xiàn)S患者血液TNF-α、IL-1β表達(dá)水平顯著增高[18，19]。本研究顯示，模型組TNF-α及IL-1β較正常組顯著升高，與報(bào)道一致。經(jīng)聯(lián)用組、羚羊角組及鉤藤組治療后，各組腦組織及海馬區(qū)TNF-α及IL-1β表達(dá)量均較模型組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。且聯(lián)用組腦組織及海馬區(qū)TNF-α及IL-1β表達(dá)較羚羊角組顯著降低(P<0.05)。提示，聯(lián)用組通過(guò)同時(shí)抑制前炎癥因子TNF-α及IL-1β表達(dá)而發(fā)揮腦損傷保護(hù)作用，且療效優(yōu)于羚羊角與鉤藤。

Glu與Asp是重要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[20,21]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β等促炎性細(xì)胞因子可促進(jìn)神經(jīng)元興奮性增加，從而促進(jìn)Glu、Asp等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)大量表達(dá)，介導(dǎo)“神經(jīng)毒”導(dǎo)致FS腦損傷[9,22]。有研究顯示，F(xiàn)S大鼠Glu、Asp顯著升高，GABA的含量顯著降低[9]。本研究結(jié)果顯示，模型組Glu、Asp含量較正常組顯著升高，與報(bào)道一致。經(jīng)聯(lián)用組、羚羊角組及鉤藤組治療后，各組Asp、Glu含量均較模型組顯著降低(P<0.01，P<0.05)。聯(lián)用組Asp較鉤藤組顯著降低(P<0.05)。研究結(jié)果提示，聯(lián)用組通過(guò)同時(shí)抑制Asp、Glu等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而腦損傷保護(hù)作用，且療效優(yōu)于羚羊角與鉤藤。

綜上，聯(lián)用組可顯著抑制FS所致大鼠腦損傷，其作用強(qiáng)度優(yōu)于羚羊角、鉤藤單獨(dú)使用，其作用機(jī)制可能與抑制促炎癥因子TNF-α、IL-1β及興奮性氨基酸Asp、Glu表達(dá)有關(guān)。