賀 欣 張目涵 路 瑤 趙美華 馬 娜 龔 陳 李林靜 馮百歲

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450014)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一種以腹痛、腹瀉和黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)的反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病。其主要包括克羅恩病(Crohn′s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)兩種。目前為止IBD的病因和發(fā)病機(jī)制目前為止仍不是十分清楚，但多數(shù)認(rèn)為是由遺傳和環(huán)境因素，腸道菌群的改變和免疫調(diào)節(jié)紊亂等共同造成了腸黏膜屏障功能的損傷，繼而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1]。腸上皮細(xì)胞作為腸黏膜屏障的重要組成成分，對(duì)于抵御腸腔內(nèi)有害物質(zhì)的入侵和參與腸黏膜免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)等均具有重要作用[2]。而近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)存在于腸道內(nèi)輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)亞群中的Th17細(xì)胞與IBD疾病的發(fā)生發(fā)展過程有著密切的聯(lián)系。Th17細(xì)胞及其分泌的特異性免疫因子IL-17和IL-22等可以在腸黏膜內(nèi)介導(dǎo)Th17型免疫反應(yīng)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)IBD尤其是CD疾病的發(fā)生[3,4]。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg cell)可以通過分泌特異性免疫抑制因子IL-10的方式對(duì)腸黏膜免疫過程起到負(fù)向調(diào)節(jié)的抑制作用[5]。因此，近年來Th17/Treg細(xì)胞的免疫平衡作為新興的細(xì)胞免疫平衡機(jī)制在腸黏膜免疫過程中起到非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過在Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)T84細(xì)胞單層的方式用于體外環(huán)境下模擬腸黏膜屏障，通過測量模擬腸黏膜屏障中跨上皮電阻(Transepithelial electric resistance,TER)值和辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)通過率在不同濃度和不同時(shí)間IL-17、IL-22和IL-10干預(yù)前后的改變，并對(duì)測量結(jié)果進(jìn)行縱向和橫向的對(duì)比，從而在模擬腸黏膜屏障的體外環(huán)境下探究不同濃度和不同作用時(shí)間的Th17/Treg相關(guān)因子對(duì)T84細(xì)胞單層通透性的影響，并為進(jìn)一步明確IBD疾病中腸黏膜屏障Th17/Treg的免疫平衡以及對(duì)IBD疾病相關(guān)免疫機(jī)制的探究提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑 人類結(jié)腸癌腺癌T84細(xì)胞株(購于中科院上海細(xì)胞所)，重組人IL-17A/IL-22/IL-10(購于美國PeproTech公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清(購于美國Gibco-BRL公司)，辣根過氧化物酶(HRP)(購于鼎國生物有限公司)，過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(購于博奧森生物技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1T84細(xì)胞單層的培養(yǎng) 用DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)T84細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入15 mmol/L HEPES和100 U/ml青霉素，于37℃，5%CO2的條件在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。隔日換液并每日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)融合至80%左右時(shí)，使用0.25%胰酶-EDTA進(jìn)行消化并傳代。

1.2.2T84細(xì)胞單層通透性的檢測 將(5×105～1×106)cells/cm2的T84細(xì)胞種植在Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)(如圖1)，以T84細(xì)胞單層的跨上皮電阻(TER)和大分子辣根過氧化物酶(HRP)通過率作為評(píng)價(jià)T84細(xì)胞單層通透性的指標(biāo)。從培養(yǎng)第3天開始檢測TER值的變化，一般再培養(yǎng)7～11 d 以后TER即可達(dá)到1 000/cm2以上，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.3T84細(xì)胞TER的測定 T84細(xì)胞單層接種到Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)后，每日使用Millicell-ERS細(xì)胞電阻儀對(duì)T84細(xì)胞單層的TER值進(jìn)行檢測。當(dāng)TER達(dá)到1 000 Ω/cm2以上時(shí)，以每4個(gè)跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)為一組，將各個(gè)Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)隨機(jī)分為正常對(duì)照組和單因子實(shí)驗(yàn)組。把不同濃度(10、20、40、60、80、100、500 ng/ml)的IL-17、IL-22和IL-10細(xì)胞因子加入到相應(yīng)各組跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)的腸腔側(cè)中，分別在0、6、12、24和48 h時(shí)測量T84細(xì)胞的TER變化。計(jì)算公式為：TER值=(實(shí)際測量值-空白孔測量值)×Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)的有效膜面積，最終結(jié)果單位用Ω/cm2表示。

1.2.4T84細(xì)胞HRP通過率的檢測 使用改良版的Jacob等[8]報(bào)道的檢測HRP通過率的方法，作為評(píng)價(jià)T84細(xì)胞單層通透性的指標(biāo)。具體如下：①在Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)中T84細(xì)胞模擬腸黏膜屏障的腸腔側(cè)加入各種不同濃度(10、20、40、60、80、100、500 ng/ml)的IL-17、IL-22和IL-10細(xì)胞因子。②加入細(xì)胞因子后的0、6、12、24和48 h時(shí)將Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)的上下腔培養(yǎng)基進(jìn)行更換，并在培養(yǎng)基的上室中加入0.001 mmol/L的HRP，并放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。③再過2 h之后收集上下兩室的細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在6、24和48時(shí)分別采用ELISA方法檢測基底膜側(cè)HRP的通過率。計(jì)算公式為：HRP通過率=Ca×Va/(Cb×Vb +Ca×Va)，其中Ca代表基底側(cè)HRP濃度，Va代表基底側(cè)培養(yǎng)液體積，Cb代表腸腔側(cè)HRP濃度， Vb代表腸腔側(cè)培養(yǎng)液體積，計(jì)算結(jié)果用百分比表示。

圖1 Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)Fig.1 Transwell cell transmembrane culture system

2 結(jié)果

2.1不同濃度和時(shí)間的IL-17對(duì)T84細(xì)胞單層模擬的腸黏膜屏障功能的影響 如圖2、3。不同濃度組IL-17中的TER值相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.574，P<0.001)，不同時(shí)間對(duì)各組的TER值相比差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1302.853，P<0.001)，并且不同濃度和時(shí)間對(duì)各組TER值均存在交互作用(F=67.632，P<0.001)。

不同濃度組IL-17中的HRP值相比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=104.431，P<0.001)，不同時(shí)間對(duì)各組HRP值的效應(yīng)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=352.458，P<0.001)，并且不同濃度和時(shí)間對(duì)各組TER值均存在交互作用(F=47.122，P<0.001)。

2.2不同濃度和時(shí)間的IL-22對(duì)T84細(xì)胞單層模擬的腸黏膜屏障功能的影響 如圖4、5。不同濃度IL-22組中的TER值相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.913，P<0.001)，不同時(shí)間對(duì)各組的TER值相比差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=583.675，P<0.001)，并且不同濃度和時(shí)間對(duì)各組TER值均存在交互作用(F=15.892，P<0.001)。

圖2 不同濃度IL-17對(duì)T84細(xì)胞單層Transwell中相對(duì)TER的比較Fig.2 Comparison of comparative TER in T84 cell monolayer Transwell with different concentr-ations of IL-17Note:*.P<0.05.

不同濃度組IL-22中的HRP值相比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=236.325，P<0.001)，不同時(shí)間對(duì)各組HRP值的效應(yīng)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 008.014，P<0.001)，并且不同濃度和時(shí)間對(duì)各組TER值均存在交互作用(F=49.150，P<0.001)。

2.3不同濃度和時(shí)間的IL-10對(duì)T84細(xì)胞單層模擬的腸黏膜屏障功能的影響 如圖6、7。不同濃度IL-10組中的TER值相比組間沒有差別，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.486，P=0.267)，不同時(shí)間對(duì)各組TER值的效應(yīng)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.076，P=0.403)，并且不同濃度和不同時(shí)間下各組對(duì)TER值并不存在一定的交互作用(F=0.436 1，P=0.781)。

圖3 不同濃度IL-17對(duì)T84細(xì)胞單層Transwell中HRP通過率的比較Fig.3 Comparison of HRP passing rates in T84 cell monolayer Transwell at different concentrations of IL-17Note:*.P<0.05.

圖4 不同濃度IL-22對(duì)T84細(xì)胞單層Transwell中相對(duì)TER的比較Fig.4 Comparison of comparative TER in T84 cell monolayer Transwell with different concentra-tions of IL-22Note:*.P<0.05.

圖5 不同濃度IL-22對(duì)T84細(xì)胞單層Transwell中HRP通過率的比較Fig.5 Comparison of HRP passing rates in T84 cell monolayer Transwell at different concentrations of IL-22Note:*.P<0.05.

圖6 不同濃度IL-10對(duì)T84細(xì)胞單層Transwell中相對(duì)TER的比較Fig.6 Comparison of comparative TER in T84 cell monolayer Transwell with different concentrat-ions of IL-10

圖7 不同濃度IL-10對(duì)T84細(xì)胞單層Transwell中HRP通過率的比較Fig.7 Comparison of HRP passing rates in T84 cell monolayers Transwell at different concentrations of IL-10Note:*.P<0.05.

不同濃度IL-10組中的HRP值相比也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.576，P=0.684)，不同時(shí)間對(duì)各組HRP值的效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.547，P<0.001)，但不同濃度和不同時(shí)間對(duì)各組TER值也不存在明顯交互作用(F=0.761，P=0.546)。

3 討論

IBD是一種病因尚不是十分清楚的累及腸道各個(gè)部位的特發(fā)性炎癥性疾病。流行病學(xué)研究顯示不同國家和地區(qū)人群中IBD的發(fā)病率存在顯著差異，并且近年來其在發(fā)展中國家的發(fā)病率也呈逐年增高的趨勢(shì)[9]。近年來越來越多的研究表明Th細(xì)胞和Treg細(xì)胞及其分泌的各種免疫因子之間的失衡被認(rèn)為是IBD發(fā)病免疫機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。存在于腸道內(nèi)的Th細(xì)胞主要分為Th1、Th2和Th17細(xì)胞三種，其中Th1和Th17細(xì)胞可以共同介導(dǎo)CD疾病的免疫反應(yīng)，而Th2細(xì)胞則主要介導(dǎo)UC疾病免疫反應(yīng)的過程[10]。一般情況下在IBD的發(fā)病機(jī)制中存在著Th1/Th2免疫反應(yīng)的平衡[11,12]，而Th17細(xì)胞是近幾年來被發(fā)現(xiàn)的存在于Th細(xì)胞中的新亞型之一，活化后的Th17細(xì)胞主要分泌IL-17和IL-22等特異性免疫因子，并在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中具有重要的意義[3]。Treg細(xì)胞在IBD的發(fā)病中主要起到抑制腸黏膜免疫的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，腸黏膜內(nèi)的Th1、Th2和Th17型免疫反應(yīng)均可以激活Treg細(xì)胞并產(chǎn)生高水平的免疫抑制因子IL-10和TGF-β，繼而通過接觸抑制Th1和Th2細(xì)胞的方式對(duì)IBD發(fā)病過程中Th1/Th2細(xì)胞之間的免疫平衡起到一定的維持作用[13]。除此之外，腸黏膜的Treg細(xì)胞還可以與Th17細(xì)胞共同進(jìn)行雙向的調(diào)控和轉(zhuǎn)化，從而在IBD過程中與Th17細(xì)胞形成了更加重要的Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡，而主要由Th17細(xì)胞分泌的IL-17和IL-22，以及主要由Th10細(xì)胞分泌的IL-10這三種細(xì)胞因子也被稱為Th17/Treg細(xì)胞因子[14]。

正常人體內(nèi)主要由眾多腸上皮細(xì)胞構(gòu)成腸黏膜屏障的主體，此外相鄰上皮細(xì)胞之間的緊密連接和各種緊密連接蛋白在參與構(gòu)成腸黏膜屏障中同等重要。成熟的腸黏膜屏障不僅可以在腸道中作為天然屏障阻擋外來有害物質(zhì)的入侵，還可以參與抗原提呈等腸黏膜內(nèi)多種免疫反應(yīng)并維持腸道免疫的穩(wěn)態(tài)[15]。同樣有關(guān)腸黏膜屏障的通透性除了包括在腸上皮細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行的跨腸上皮細(xì)胞途徑之外，還同樣包括從腸上皮細(xì)胞旁邊的緊密連接蛋白通過的細(xì)胞旁途徑[16]。本實(shí)驗(yàn)采用Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)所建立的腸黏膜屏障體外模型，并在該培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)T84細(xì)胞單層，通過對(duì)T84細(xì)胞單層TER數(shù)值的改變以及HRP通過率的變化進(jìn)行檢測，以此作為衡量腸黏膜屏障功能的指標(biāo)。Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)是一種體外的模擬腸黏膜屏障系統(tǒng)，該系統(tǒng)的底層有一層帶有微孔的人工膜，可以像人體腸黏膜一樣具有通透性。T84細(xì)胞株來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞。該細(xì)胞不僅可以在Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中自發(fā)形成極化的單層上皮，并且可以像真實(shí)腸黏膜屏障一樣具有很高的跨上皮電阻[17]。TER數(shù)值的改變主要與T84細(xì)胞單層的完整性密切相關(guān)[18]，而HRP是一種相對(duì)分子質(zhì)量為44 000的大分子蛋白質(zhì)，當(dāng)腸黏膜屏障健康完整時(shí)只有少于0.05%的極少量HRP可被轉(zhuǎn)運(yùn)至皮下。因此當(dāng)T84細(xì)胞單層被破壞時(shí)就會(huì)有較多的HRP漏到下室[19]。IL-17是一種主要由Th17細(xì)胞分泌的可以在腸道局部組織中出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的重要促炎因子。有研究發(fā)現(xiàn)在IBD患者外周血以及結(jié)腸黏膜組織中，均可以發(fā)現(xiàn)IL-17的表達(dá)水平明顯高于正常，從而提示其在IBD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[20]。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，用不同濃度IL-17作用于T84細(xì)胞，當(dāng)處理時(shí)間小于6 h時(shí)，在基底膜側(cè)檢測到的HRP通過率均少于0.05%，并且T84細(xì)胞單層的TER值也依然大于1 000 Ω/cm2。但當(dāng)處理時(shí)間大于6 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長TER值會(huì)逐漸下降并且HRP通過率也會(huì)逐漸增加。因此可以說明當(dāng)IL-17作用時(shí)間較短時(shí)不會(huì)破壞腸上皮細(xì)胞的完整性。當(dāng)IL-17濃度小于20 ng/ml時(shí)，各組的TER值和HRP通過率均無明顯變化，因此可以說明小劑量的IL-17不會(huì)破壞上皮細(xì)胞的完整性，甚至可以刺激腸黏膜發(fā)生一定的免疫耐受。但當(dāng)IL-17濃度大于 20 ng/ml 時(shí)，T84細(xì)胞單層的TER值會(huì)隨著IL-17濃度的增加開始逐漸下降，HRP通過率也會(huì)隨著IL-17濃度的增加而不斷增加。因此說明在一定的劑量范圍內(nèi)，IL-17可以破壞T84細(xì)胞單層所模擬的腸黏膜屏障并增加其通透性。但當(dāng)IL-17濃度大于100 ng/ml時(shí)，繼續(xù)增加IL-17濃度，與100 ng/ml濃度組相比TER值和HRP通過率并未發(fā)生明顯變化，從而說明當(dāng)濃度達(dá)到100 ng/ml時(shí)，TER值及HRP的通過率均已經(jīng)達(dá)到極值。而IL-22是最近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一種多由Th17細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子。很多研究表明IL-22不僅可以參與STAT3信號(hào)通路的活化，放大炎癥反應(yīng)并增強(qiáng)抗凋亡和促增殖基因的轉(zhuǎn)錄，還可以在急性結(jié)腸炎中誘導(dǎo)黏蛋白的表達(dá)和杯狀細(xì)胞的重塑，甚至可以誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的再生[21]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，不同濃度IL-22作用于T84細(xì)胞后，當(dāng)處理時(shí)間小于6 h時(shí)，在基底膜側(cè)檢測到的HRP的通過率均小于0.05%，并且T84細(xì)胞單層的TER值也均大于1 000 Ω/cm2。但當(dāng)處理時(shí)間大于6 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長TER值逐漸下降并且HRP通過率逐漸增高，因此可以說明當(dāng)作用時(shí)間較短時(shí)IL-22不會(huì)破壞上皮細(xì)胞的完整性。當(dāng)IL-22的濃度繼續(xù)增加時(shí)，各組T84細(xì)胞單層的TER值也會(huì)繼續(xù)下降，并且各組的HRP通過率也會(huì)繼續(xù)增加，因此說明IL-22也可以造成腸黏膜屏障的受損，并使其通透性明顯增加。但當(dāng)IL-22的濃度大于100 ng/ml時(shí)，繼續(xù)增加IL-22濃度之后可以發(fā)現(xiàn)TER值略有回升，HRP的通過率反而略有下降，因此可能說明較高濃度的IL-22反而可以發(fā)揮修復(fù)腸黏膜細(xì)胞完整性的作用。IL-10是Treg細(xì)胞分泌的重要的抑炎因子之一。IL-10可以維持腸道黏膜屏障的完整性,協(xié)助腸道益生菌改善腸黏膜炎癥反應(yīng)，并防止IBD過程的發(fā)生和惡化[22]。已有動(dòng)物研究表明當(dāng)IL-10缺失時(shí)可直接損傷腸黏膜屏障，從而導(dǎo)致由Th17細(xì)胞介導(dǎo)的自發(fā)性的類似于CD的結(jié)腸炎的發(fā)生[23]。而在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度IL-10作用于T84細(xì)胞之后，隨著時(shí)間和濃度的增加TER值及HRP通過率均未發(fā)生明顯變化。因此可以說明IL-10作用于T84細(xì)胞單層后既不破壞腸黏膜屏障的完整性，又不引起腸上皮細(xì)胞通透性的增加，這也再次證實(shí)了Treg細(xì)胞及其相關(guān)免疫因子在IBD疾病的發(fā)病過程中可能起到保護(hù)作用。

綜上所述，IL-17和IL-22在一定濃度范圍內(nèi)可以增加T84細(xì)胞單層所模擬腸黏反而膜屏障的通透性，并且隨著IL-17和IL-22這兩種因子作用時(shí)間的延長和作用濃度的增高，T84細(xì)胞單層通透性的破壞也會(huì)越來越明顯。但I(xiàn)L-10因子并不引起T84細(xì)胞單層通透性發(fā)生變化。由于Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)在體外模擬腸黏膜屏障的局限性，并且有關(guān)Th17/Treg免疫平衡在T84細(xì)胞單層模擬的腸黏膜屏障通透性的具體作用機(jī)制仍不完全清楚，因此期待其他動(dòng)物試驗(yàn)甚至是人體體內(nèi)腸黏膜試驗(yàn)等更多的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行更加深入的研究。