劉婷，孔銘，劉麗芳，李松林*

(1.中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009;2.江蘇省中醫(yī)藥研究院和中國中醫(yī)科學(xué)院江蘇分院中藥代謝組研究室，江蘇 南京 210028;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥質(zhì)量研究室，江蘇 南京 210028)

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi (SBG)的干燥根，氣微，味苦，性寒；歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)；具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎的功效[1]，是臨床常用藥材。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩具有抗菌、抗炎、保護(hù)心腦血管等藥理作用[2-3]。黃芩主要含有黃酮類化學(xué)成分[4-7]，其中黃芩苷為主要成分，具有抗病毒、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)的作用。《中國藥典》(2015年版，一部)中以黃芩苷(≥9.0%)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)黃芩藥材質(zhì)量優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)，此外黃芩中還含有漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷和芹菜素等黃酮類化學(xué)成分，它們也都具有一定的抗菌、抗病毒及解熱抗炎的功效。黃芩中還含有苯乙醇苷類化學(xué)成分，其中毛蕊花糖苷是黃芩中一種主要的苯乙醇苷類成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)的活性[8-9]。

黃芩主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河南、河北、山西、甘肅等地，其中河北、山西、內(nèi)蒙古產(chǎn)量最大[10]?，F(xiàn)行的黃芩等級(jí)規(guī)格的劃分是依據(jù)1984年國家醫(yī)藥管理局和衛(wèi)生部聯(lián)合頒布的《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[11]，將黃芩分為條芩和枯芩兩種規(guī)格，條芩系指內(nèi)部充實(shí)的新根、幼根，枯芩系指枯老腐朽的老根。其中，又根據(jù)條芩的長度與直徑將其細(xì)分為一等和二等兩種等級(jí)，一等條長10 cm以上，中部直徑1 cm以上；二等條長4 cm以上，中部直徑1 cm以下，但不小于0.4 cm[12]。然而，目前的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)僅以外觀性狀為指標(biāo)，缺乏對(duì)藥材內(nèi)在品質(zhì)的描述，現(xiàn)有等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)是否體現(xiàn)出黃芩藥材內(nèi)在質(zhì)量尚缺乏深入研究。本研究采集了三個(gè)產(chǎn)地的不同商品規(guī)格的條芩，采用創(chuàng)建的HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芩中9種主要活性成分的含量[13-17]，通過與外觀性狀比較及聚類分析，探討黃芩中條芩商品規(guī)格與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芩藥材采集于河北、山東、山西，由江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林研究員鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi (SBG)的干燥根。藥材信息見表1。

對(duì)照品黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A購自中國食品藥品檢定研究院(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)分別為110715-200514、071114、051222、080325);對(duì)照品黃芩素、白楊素、夏佛塔苷、芹菜素、毛蕊花糖苷購自四川省成都市維克奇生物科技有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)分別為wkq16011504、wkq16032304、wkq16071404、wkq15122405、wkq16062004)；色譜級(jí)甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)；色譜級(jí)乙腈(美國天地有限公司)；超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

AT201十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)；Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);Waters 2996、2489紫外檢測(cè)器(美國Waters公司)；KQ-500D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)；粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；DK-S28型恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Microfuge16臺(tái)式微量離心機(jī)，美國貝爾曼庫爾特有限公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥材外觀性狀的測(cè)定

對(duì)河北、山東、山西3個(gè)不同產(chǎn)地，條芩一等、條芩二等2種不同規(guī)格，共18批黃芩藥材外觀性狀進(jìn)行測(cè)定。每批隨機(jī)抽取56根藥材，分別用直尺測(cè)量其長度、直徑，并用電子秤稱取每根藥材重量，記錄藥材長度、直徑及重量的平均值。同時(shí)對(duì)藥材外觀進(jìn)行拍照記錄。測(cè)定及拍照結(jié)果見表2及圖1。

圖1 黃芩藥材照片

產(chǎn)地等級(jí)編號(hào)河北一等JSPACM-65-1JSPACM-65-2JSPACM-65-3二等JSPACM-65-4JSPACM-65-5JSPACM-65-6山東一等JSPACM-65-7JSPACM-65-8JSPACM-65-9二等JSPACM-65-10JSPACM-65-11JSPACM-65-12山西一等JSPACM-65-13JSPACM-65-14JSPACM-65-15二等JSPACM-65-16JSPACM-65-17JSPACM-65-18

表2 黃芩藥材外觀性狀測(cè)定

本研究對(duì)不同產(chǎn)地(河北、山東、山西)一等和二等條芩藥材外觀性狀進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地(河北、山東、山西)的一等條芩藥材條長和中部直徑均大于二等，且一等條芩藥材重量顯著大于二等，其中山東一等條芩條長15.50 cm、中部直徑1.25 cm、根部重量為14.98 g，顯示為各項(xiàng)外觀指標(biāo)最優(yōu)的黃芩藥材。但不同產(chǎn)地之間的外觀比較有一定差異，如山東的二等條芩長度、直徑均大于河北的一等條芩。條芩藥材外觀性狀的測(cè)定結(jié)果與《76種中藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)黃芩藥材商品規(guī)格的劃分標(biāo)準(zhǔn)基本一致，表明目前市場(chǎng)黃芩規(guī)格的劃分以外觀為主。

2.2 黃芩中9個(gè)主要活性成分的含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液的制備

取黃芩藥材粉末0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲提取30 min，放冷。用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，吸取1 mL上清液，于13 000 r/min 離心10 min。即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

依次稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，使得對(duì)照液中的含量分別為999.44 μg/mL、269.92 μg/mL、59.95 μg/mL、10.26 μg/mL、7.99 μg/mL、4.10 μg/mL、4.10 μg/mL、4.11 μg/mL、5.59 μg/mL。

2.2.3 色譜條件

色譜柱為AltimaTMC18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫：0～20 min，10%～25%乙腈；20～35 min，25%～30%乙腈；35～40 min，30%～40%乙腈；40～50 min，40%～50%乙腈；50～60 min，50%乙腈；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長280 nm。

2.2.4 專屬性考察

精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄60 min內(nèi)的色譜圖。結(jié)果顯示，供試品液相色譜圖中能指認(rèn)黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A共6種黃酮類成分，分離良好。另外3種成分夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷無法指認(rèn)?；旌蠈?duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖3。

圖2 化合物結(jié)構(gòu)圖1.黃芩苷;2.漢黃芩苷;3.黃芩素;4.漢黃芩素;5.白楊素;6.千層紙素A;7.夏佛塔苷;8.芹菜素;9.毛蕊花糖苷

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇逐級(jí)稀釋成5個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制峰面積與濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷、芹菜素和毛蕊花糖苷的回歸方程分別為Y=26 623X+165 348，R2=1.000 0、Y=28 027X+26 890，R2=0.999 9、Y=48 297X-96 525，R2=0.999 8、Y=36 185X+88 767，R2=0.995 6、Y=33 302X-1633，R2=0.998 7、Y=23 068X+6313，R2=0.984 1、Y=9977X-133，R2=0.999 9、Y=24 349X-3291，R2=0.998 2、Y=5231X-521，R2=1.000 0。結(jié)果表明，上述9種成分在62.47～994.44、16.87～269.92、3.75～59.95、0.64～10.26、0.50～7.99、0.26～4.10、0.26～4.10、0.26～4.11、0.35～5.59 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 高效液相色譜圖A-混合對(duì)照品;B-供試品(1-黃芩苷;2-漢黃芩苷;3-黃芩素;4-漢黃芩素;5-白楊素;6-千層紙素A;7-夏佛塔苷;8-毛蕊花糖苷;9-芹菜素)

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組分色譜峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、夏佛塔苷、芹菜素、毛蕊花糖苷峰面積的RSD值分別為0.38%、0.55%、1.93%、0.83%、1.15%、0.91%、0.91%、1.19%和1.07%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液(編號(hào)JSPACM-65-1)，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析，記錄各組分峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A的RSD值分別為0.31%、0.29%、0.77%、0.48%、0.60%和1.99%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批黃芩藥材粉末(編號(hào)JSPACM-65-1)，平行制備6份供試品溶液。在“2.2.3”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，記錄各組分峰面積。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.87%、1.04%、1.54%、4.30%、1.28%和4.61%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的黃芩藥材粉末(編號(hào)JSPACM-65-1)9份，每份0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分為3組，按樣品中各指標(biāo)成分量的50%、100%、150%分別加入一定量的對(duì)照品，用70%乙醇提取并稀釋至50 mL。在“2.2”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果見表3，6個(gè)主要成分的加樣回收率結(jié)果均符合要求。

2.2.10 含量測(cè)定

取18批黃芩藥材粉末，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備，每批藥材平行實(shí)驗(yàn)3次。在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算藥材中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素和千層紙素A的含量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，(1)不同產(chǎn)地條芩一等藥材比較：山西產(chǎn)黃芩的黃芩苷、白楊素、千層紙素A含量均最高，分別為18.57%、0.14%、0.21%；山東產(chǎn)黃芩的黃芩素、漢黃芩素含量最低，分別為0.43%、0.09%；而總含量山西產(chǎn)的黃芩最高。其中同樣一等的河北黃芩的黃芩苷含量比山西黃芩低14.11%，黃芩素含量低32.83%，白楊素和千層紙素A含量山西與山東存在明顯差異，山西比山東分別高3.1倍、2.1倍。(2)不同產(chǎn)地條芩二等藥材比較：河北產(chǎn)地的黃芩苷、漢黃芩苷含量最低，分別為16.73%、2.77%；山西產(chǎn)地的黃芩素、白楊素、千層紙素A含量最高，分別為1.08%、0.13%、0.18%；總含量山東產(chǎn)的黃芩最高。其中，河北和山東產(chǎn)黃芩的漢黃芩苷和漢黃芩素含量差異較大，漢黃芩苷含量河北是山東的1.2倍，漢黃芩素含量河北比山東高約1倍。(3)相同產(chǎn)地不同等級(jí)條芩藥材比較：其中河北和山東的黃芩苷含量均是二等藥材顯著高于一等藥材，其余各指標(biāo)成分的含量一、二等之間未見明顯差異。從含量測(cè)定結(jié)果來看不同產(chǎn)地之間黃芩有效成分含量有一定差異，但各不同等級(jí)之間未見明顯差異，結(jié)果表明黃芩藥材各主要成分含量與黃芩商品規(guī)格劃分結(jié)果并不一致。

表3 加樣回收率試驗(yàn)(n=3)

圖4 黃芩含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3 聚類分析

為了更為直觀的反映黃芩藥材商品規(guī)格與內(nèi)在成分含量的相關(guān)性，采用SPSS Statistics 19分析軟件分別對(duì)不同產(chǎn)地(河北、山東、山西)一等和二等條芩藥材含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖5。聚類分析將不同產(chǎn)地(河北、山東、山西)一等和二等條芩藥材分為兩類，河北一等3批藥材、河北二等2批藥材、山東一等1批藥材共6批藥材被分為一類，其余12批藥材被分為一類。聚類分析結(jié)果與黃芩等級(jí)劃分結(jié)果并不一致，提示傳統(tǒng)的黃芩藥材商品規(guī)格劃分與其內(nèi)在成分含量沒有相關(guān)性。

圖5 黃芩含量測(cè)定結(jié)果聚類分析(n=3)

2.4 相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探究黃芩藥材商品規(guī)格與每個(gè)內(nèi)在成分含量之間的關(guān)系，采用SPSS Statistics 19分析軟件分別對(duì)不同等級(jí)的18批黃芩藥材含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果見表4。由相關(guān)性分析可知，黃芩藥材等級(jí)與黃芩苷含量的相關(guān)系數(shù)為0.637(0

表4 黃芩等級(jí)與6個(gè)成分含量的相關(guān)性分析

注：P<0.05，相關(guān)性顯著；P<0.01，相關(guān)性極顯著。

3 討論

黃芩藥材規(guī)格劃分的歷史由來已久。梁代陶弘景在《本草經(jīng)集注》[18]中提出：“圓者名子芩，破者名宿草(枯芩)，其腹中皆爛，故名腐腸?！边@是首次將黃芩分為子芩和枯芩兩種類型。明代李時(shí)珍[19]進(jìn)一步對(duì)子芩和枯芩進(jìn)行了區(qū)分，提出“宿芩乃舊根，多中心空，外黃內(nèi)黑；子芩乃新根，多內(nèi)實(shí)”的觀點(diǎn)。其他中醫(yī)藥典籍中常記載有2種規(guī)格，即子芩(條芩)和宿芩(枯芩)，兩者由于生長年限不同，也有認(rèn)為兩者是藥性不同，功能主治有差異。近年來隨著黃芩需求量的不斷增加和野生植物資源的日益枯竭，黃芩栽培品受到有關(guān)部門的重視，目前黃芩以栽培為主，野生較少[10,20]。栽培年限1～3年不等，野生生長期在3年以上。野生黃芩采集以3～4月為佳，栽培黃芩11月采集為佳。一般認(rèn)為條芩色黃堅(jiān)實(shí)者質(zhì)優(yōu)[10,21]，顏色偏綠者質(zhì)量為差，外觀性狀是評(píng)價(jià)其質(zhì)量優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，黃芩等級(jí)越高，黃芩苷和千層紙素A含量越低，與其他成分無相關(guān)。但整體的聚類分析結(jié)果顯示，黃芩等級(jí)與其內(nèi)在質(zhì)量不一致。黃芩中的代表性活性成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和白楊素等的含量與傳統(tǒng)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均不相符，原有的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)僅能反映黃芩外觀的優(yōu)劣，尚不能體現(xiàn)黃芩內(nèi)在質(zhì)量的好壞，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與黃芩產(chǎn)地、種植、加工方式的變化有關(guān)。此外，隨著黃芩在生產(chǎn)、流通的不斷變化及藥材實(shí)際規(guī)格的改變，原有的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的合理性尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。建議開展以內(nèi)在質(zhì)量和臨床療效為依據(jù)的黃芩藥材分級(jí)研究，將藥材外觀性狀、內(nèi)部化學(xué)組分和療效結(jié)合起來進(jìn)行量化研究，完善黃芩藥材商品等級(jí)規(guī)范。