隋雨桐，遲文成，姜家康

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中約 80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是由多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)、多因素參與的復(fù)雜過程。研究證明 PI3K/Akt 信號(hào)通路在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活在肺癌中很常見，被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的重要通路，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起腫瘤[1-4]。

本研究所用芪杉膠囊以益氣健脾、養(yǎng)陰潤(rùn)肺、解毒消癥為法組方，以健脾補(bǔ)中調(diào)理氣機(jī)為先，兼清熱解毒散結(jié)。前期根據(jù)多年的隨訪和治療的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)該復(fù)方不僅可以明顯改善患者的機(jī)體免疫力，還可以減輕疾病給患者帶來的痛苦，除增加患者的生存率外，在增加患者生存質(zhì)量，減少腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移方面也取得了很好的療效。故本研究主要探究芪杉膠囊對(duì)肺癌A549細(xì)胞PI3KAKt信號(hào)通路的影響，以期為臨床治療NSCLC提供可行性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑

A549人肺癌細(xì)胞株，購自于上海富恒生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基(批號(hào)：ABB212917)、PBS緩沖液(批號(hào)：AB10100599)，購于Hyclone公司；CellTiter 96?AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，購于美國Promega公司(批號(hào)：000125538)；Annexin V-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CA1120)，購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；mTOR(批號(hào)：2972S)、PI3K(批號(hào)：3811S)、AKT(批號(hào)：9272S)、Caspase-3(批號(hào)：9665S)、Caspase-9(批號(hào)：9502S)、Cytochrome c(批號(hào)：4272S)一抗，購于美國Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：CW0014S)；RIPA加強(qiáng)型裂解液(批號(hào)：CW2333S)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號(hào)：CW0022S)；蛋白酶抑制劑混合物(批號(hào)：CW2200S)；過硫酸銨(APS)(批號(hào)：CW0032S)；四甲基乙二胺(TEMED)(批號(hào)：CW0034S)；蛋白示蹤上樣緩沖液(批號(hào)：CW0052S)；Tris-Glycine SDS電泳緩沖液(批號(hào)：CW0045S)；Tris-Glycine轉(zhuǎn)膜緩沖液(批號(hào)：CW0044S)；TBST(批號(hào)：CW0043S)；高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CW0049M)；Western Blot封閉奶粉(批號(hào)：CW2134S)；醋酸纖維素膜(NC膜)，購于美國Pall Life Sciences公司(批號(hào)：66485)；超純RNA提取試劑盒(批號(hào)：CW0581S)，HiFi-MMLV cDNA Syntheses Kit(批號(hào)：CW0744M)，UltraSYBR Mixture(High ROX)(批號(hào)：CW2602M)，5x RNA Loading Buffer(批號(hào)：CW0611S)，DNase 1(RNase Free)(批號(hào)：CW2090S)，購于北京康為世紀(jì)生物有限公司。

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)(上海蘇靜實(shí)業(yè)有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；低溫高速離心機(jī)(德國Beckman公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；轉(zhuǎn)膜設(shè)備(美國Bio-Rad公司)；成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；分光光度計(jì)(美國Thermo scientific公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含藥血清的制備

Wistar雄性大鼠隨機(jī)分成空白組、芪杉膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組和順鉑組。根據(jù)臨床成人用藥劑量的1/2、1和2倍為芪杉膠囊低、中、高劑量，灌胃給藥劑量為8.35 g/kg，16.14 g/kg，36.57 g/kg，連續(xù)灌胃3 d，第3天完成灌藥1 h后，乙醚麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，將取得的血樣靜置1 h以上，離心2 500 r/min，4℃，10 min后取血清，按組別混合，56℃，30 min滅活，分裝，-2℃冰箱保存。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的腫瘤細(xì)胞株于37℃迅速溶解，將細(xì)胞懸液加入到含有血清的培養(yǎng)基中，離心3 000 r/min，3 min。棄去上層培養(yǎng)基，加入含血清培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞沉淀后，加入到T25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，至37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，加入1 mL胰酶消化液潤(rùn)洗細(xì)胞表面。倒掉胰酶，再加入2 mL胰酶，進(jìn)行消化。消化3 min，加入含血清培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞。按1∶3傳代，每3天傳代1次。細(xì)胞消化步驟同上，倒掉上層液體，加入細(xì)胞凍存液。吹打均勻后，分裝到細(xì)胞凍存管中，置于細(xì)胞凍存盒中，-80℃冰箱保存。

1.3.3 MTT法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積為100 μL。置二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下孵育過夜。次日，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)含藥血清高、中、低劑量組和空白對(duì)照組，各劑量組血清含量為20%。血清作用24 h后，小心吸出孔內(nèi)液體，每孔體積為100 μL不完全培養(yǎng)基，20 μLMTS染色液，培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各組吸光度值(OD)。按公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-OD受試藥組/OD對(duì)照組)×100%。

1.3.4 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

將A549細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積為1 mL。在CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)含藥血清高、中、低劑量組和空白對(duì)照組血清于藥物作用24 h后。離心收集胰酶消化后單細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞。用1×Binding Buffer緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。每個(gè)樣品管中加入100 μL細(xì)胞懸液，約1×105個(gè)細(xì)胞/每管。每管中加入5 μL AnnexinV-PE染料和10 μL 7-AAD染料，輕輕渦旋混勻后，室溫避光孵育15 min。最后，每管中加入380 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer緩沖液后，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Western-blot法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將A549細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，接種于100 mm無菌培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)24 h。高、中、低劑量組和空白對(duì)照組血清于藥物作用24 h，離心收集胰酶消化后細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，并裂解30 min。低溫離心15 000 r/min，10 min，取上清，即為細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白定量，加入緩沖液，高溫煮沸5 min，蛋白變性后，分裝保存。根據(jù)蛋白分子量制備分離膠，注入玻璃板內(nèi)后注入單蒸水隔絕空氣。凝膠40 min后，去掉上層單蒸水后注入2 mL 4%濃縮膠，凝膠30 min后，將玻璃板放入電泳槽中，加入電泳緩沖液后，向各泳道中加入蛋白樣品和蛋白Marker后，80 V恒壓跑濃縮膠，120 V恒壓跑分離膠。蛋白電泳結(jié)束后，將切除濃縮膠后的分離膠部分放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中。NC膜和濾紙置轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡后將濾紙、NC膜、凝膠、濾紙放入濕轉(zhuǎn)儀中，200 mA恒流，90 min。將轉(zhuǎn)完蛋白的NC膜染色，觀察目的蛋白的轉(zhuǎn)移情況。5%的封閉奶粉或BSA室溫封閉3 min。將NC膜放入封閉奶粉稀釋一抗中，孵育過夜。加入TBST稀釋的二抗，室溫孵育2 h。將ECL發(fā)光試劑加到NC膜上后，避光反應(yīng)，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.3.6 RT-PCR法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于100 mm無菌培養(yǎng)皿中，每皿5 mL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。含藥血清高、中、低劑量組和空白對(duì)照組劑量組血清含量為20%，給藥體積為8 mL。藥物作用24 h后，小心棄去皿內(nèi)液體。預(yù)冷PBS刮取細(xì)胞后，低溫離心3 000 r/min，2 min，收集細(xì)胞。提取細(xì)胞樣本中總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。用DNase Ⅰ試劑盒對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，輕輕吸打混勻，37℃孵育50 min，70℃保溫10 min。反應(yīng)結(jié)束后的cDNA放置-20℃保存。最后采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組和空白組對(duì)A549細(xì)胞增殖作用的影響，結(jié)果表明，高、中、低濃度含藥血清細(xì)胞抑制率分別為24.26%，16.44%和10.89%，芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對(duì)細(xì)胞的抑制作用越顯著(見表1)。

表1 芪杉膠囊含藥血清對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01

2.2 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組和空白組對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明高、中、低及順鉑組均對(duì)細(xì)胞凋亡有一定作用，與空白組相比，高、中、低劑量組及順鉑組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對(duì)細(xì)胞凋亡的作用越顯著(見表2，圖1)。

在凋亡圖片中：Annexin V-PE(-)/7-AAD(-)為活細(xì)胞；Annexin V-PE(+)/7-AAD(-)為早期凋亡細(xì)胞；Annexin V-PE(+)/7-AAD(+)為晚期凋亡細(xì)胞；Annexin V-PE(-)/7-AAD(+)為壞死細(xì)胞。

表2 芪杉膠囊含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01

圖1 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡

2.3 Western-blot法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組及空白組A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中劑量組及順鉑組Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Cytochrome c的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組AKT的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組mTOR的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中劑量組及順鉑組PI3K的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白表達(dá)的影響越顯著(見表3、4，圖2)。

表3 芪杉膠囊含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01

表4 芪杉膠囊含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01，*P<0.05

圖2 Western-blot法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 RT-PCR法檢測(cè)含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組及空白組A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明芪杉膠囊含藥血清高、中劑量組及順鉑組Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Cytochrome c的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組AKT的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組mTOR的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組PI3K的相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K基因表達(dá)的影響越顯著(見表5、6)。

表5 含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01

表6 含藥血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01

3 討論

PI3K/Akt通路被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路，有“抗凋亡途徑”之稱。該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起腫瘤。另外，mTOR是PI3K/Akt的下游靶點(diǎn)，PI3K/Akt信號(hào)通路通過磷酸化激活mTOR，調(diào)控相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖，從而使腫瘤細(xì)胞達(dá)到耐藥[5]。基于PI3K/Akt信號(hào)通路與NSCLC的發(fā)病及預(yù)后關(guān)系密切，針對(duì)此信號(hào)通路抑制劑的研究也在不斷進(jìn)行。目前，有些PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑已經(jīng)合成，但是這些抑制劑大多毒性劇烈，患者很難耐受，現(xiàn)只能用作生物學(xué)研究[6-9]。因此，針對(duì)多靶點(diǎn)同時(shí)抑制，并且具有低毒性的藥物是我們研究尋求的方向。中醫(yī)藥以其穩(wěn)定的療效、低毒副反應(yīng)、多向調(diào)節(jié)的特點(diǎn)成為我們探究肺癌的治療方法方向提供了思路。

本研究中，芪杉膠囊中紅豆杉、半枝蓮、白花蛇舌草等藥均有抗癌的物質(zhì)基礎(chǔ)，且多味中藥同時(shí)調(diào)節(jié)免疫功能。一方面提示該方確有抗腫瘤研究?jī)r(jià)值，另一方面，該方具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，控制癌細(xì)胞擴(kuò)散，改善癥狀的作用。正常細(xì)胞都具有增殖、分化和凋亡三種特性，一般情況下，三者相互協(xié)調(diào)，保持平衡，在細(xì)胞衰老與更新、保持細(xì)胞數(shù)目的相對(duì)恒定中起著重要作用。細(xì)胞凋亡進(jìn)程受到抑制，細(xì)胞的增殖與凋亡失去平衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡率下降，則細(xì)胞數(shù)目不斷增加，就會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這是腫瘤形成的一個(gè)重要病理生理基礎(chǔ)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度芪杉膠囊含藥血清作用于肺癌A549細(xì)胞，均表現(xiàn)為抑制癌細(xì)胞增殖的作用，且含藥血清濃度越大，對(duì)細(xì)胞的抑制作用越顯著。細(xì)胞凋亡本質(zhì)上是程序性細(xì)胞死亡，是由于體內(nèi)、外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā)，啟動(dòng)自身內(nèi)部機(jī)制，經(jīng)過多途徑的信號(hào)傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞生命結(jié)束[12]。細(xì)胞凋亡的異常減少參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的策略始終為近年來腫瘤治療研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以不同濃度芪杉膠囊的含藥血清作用肺癌A549細(xì)胞，均對(duì)細(xì)胞凋亡有一定作用，與空白組相比，芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組細(xì)胞凋亡率顯著升高，且芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對(duì)細(xì)胞凋亡的作用越顯著。分別檢測(cè)不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組及空白組A549細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白和基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組蛋白和基因相對(duì)表達(dá)量與空白組相比，表達(dá)量降低；且芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響越顯著。

綜上所述，芪杉膠囊具有抑制腫瘤的作用，可能通過A549細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白和基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增值、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等途徑實(shí)現(xiàn)。