靳昭輝，靳冰*，高普，宋光熠，劉征堂，相田園

(1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091;2.遼寧省基礎醫(yī)學研究所，遼寧 沈陽 110005)

隨著人們生活水平的日益提高，糖尿病的發(fā)病率越來越高。糖尿病動脈粥樣硬化(diabetic atherosclerosis，DA)是糖尿病重要的遠期并發(fā)癥和死亡原因。

由于高血糖和脂代謝紊亂，導致DA大兔心臟重量(主要是左心室重量)和體重比值(即心系數(shù))的差異，這間接反映了心室壁病理性肥厚的程度。糖尿病動脈硬化的心肌損傷與糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAS)激活等相關；既往研究表明AGEs可能參與了心肌RAS的激活[1]。RAS系統(tǒng)被激活后致血管收縮，刺激心肌纖維組織增生，促進血管平滑肌增生，增加血管阻力，致使血管收縮-舒張失衡，從而引發(fā)DA心肌損傷。持續(xù)高血糖環(huán)境會導致機體產(chǎn)生大量氧自由基(ROS)[2-3]，ROS可以通過AGEs[4]引起Na+-K+-ATPase酶活性降低，誘發(fā)心肌損傷。抑制非酶糖基化過程，減少AGEs的形成，抑制RAS系統(tǒng)，升高Na+-K+-ATPase酶活性可以減少2型糖尿病動脈粥樣硬化心肌損傷的發(fā)生發(fā)展。

我們在前期4項國家自然科學基金課題研究中發(fā)現(xiàn)[5-16]：冬連三七組分(麥冬多糖40%、黃連生物堿30%、三七總皂甙30%，CONR)能夠調(diào)整DA大兔糖脂代謝紊亂，減輕其炎癥反應及氧化應激反應，并減少AGEs含量。

在既往研究結(jié)果CONR能抑制AGEs產(chǎn)生基礎上，本實驗研究了CONR減輕RASS系統(tǒng)激活,提高Na+-K+-ATPase酶活性從而改善DA兔的心肌損傷，并探討其機理。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性純種新西蘭大白兔(遼寧長生，SCXK(遼)2010-0001),體質(zhì)量(2.5±0.3)kg。實驗前適應性喂養(yǎng)1周,濕度70%±5%，溫度(22±2)℃，自由飲食，單籠喂養(yǎng)。

1.2 藥物

辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司,140213);CONR(北京同仁堂藥業(yè)公司);四氧嘧啶(BDH Limited Poole England,5272460J)。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 主要試劑

蛋白抽提試劑、Millipore 2 mg/mL、羊抗IgG、HPR；10×Tris-Glycine-SDS、5×還原樣品緩沖液、10×TBST pH 8.0、濕轉(zhuǎn)緩沖液(賽諾博)；Bis-Acrylamide、Tween-20、TEMED、BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)；Stripping Buffer、PMSF、Acrylamide、APS Ponceau S、DTT、Bromphenol Blue、麗春紅染色液(AMRESCO)；α-actinin、NP-40、Trizma base、Glycine、BSA標準品、免疫組織化學試劑盒(Sigma)；磷酸酶抑制劑(Roche)；二甲苯和乙醇、PBS緩沖液、蛋白酶K工作液(中國醫(yī)科大學基礎研究所)。

1.3.2 主要儀器

倒置相差顯微鏡;超低溫冰箱;37℃溫箱;CO2培養(yǎng)箱;優(yōu)普超純水機;酶標分析儀;全自動生化分析儀、濕盒；激光共聚焦掃描顯微鏡;微量加樣器。低溫離心機(Thermo)，凝膠成像系統(tǒng);酶標儀;MiniP-4、紫外/可見分光光度計;電泳儀(伯樂生命);濕轉(zhuǎn)電泳槽(Cavoy)；酸度計pH211(Hanna);半干槽、電動組織勻漿儀(上海琪特)、水平脫色搖床。

1.4 實驗方法

1.4.1 DA大兔模型制備

隨機取10只雄性新西蘭大白兔作為正常組進行對照,其余50只兔用于制備模型并進行實驗，耳緣靜脈推注5%四氧嘧啶(100 mg/kg)[17-18],6 h和12 h腹腔注射10%葡萄糖10 mL/只用于預防胰腺突然破壞造成的嚴重低血糖,72 h后測空腹血糖,選取空腹血糖在16.7～23.5 mmol/L兔。模型兔喂高脂飼料(含2%膽固醇、0.5%膽酸和5%豬油)30 g/(kg·d);1周后行腹主動脈內(nèi)膜球囊損傷術[17，19],術后實驗各組繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，并分別每日給予CONR450 mg/kg、150 mg/kg、50 mg/kg;辛伐他汀3 mg/kg灌胃10周，正常組喂食普通飼料30 g/(kg d),4餐/日。

1.4.2 心臟重量、左心室重量，計算心體比、左心室/體重指數(shù)測定

于最后1次灌藥后處死大兔；稱量各組大兔體質(zhì)量,迅速取出心臟,分別除去薄膜稱重,記錄心臟重量、左心室重量，計算心體比、左心室/體質(zhì)量指數(shù);留取心肌組織備用。

1.4.3 心肌組織AngⅡ、Na+-K+-ATPase含量測定

取心肌組織勻漿,離心,用放免法測定AngⅡ、Na+-K+-ATPase含量。

1.4.4 免疫組化法測定ACE在心肌組織的表達

染色步驟按免疫組織化學試劑盒說明書進行，經(jīng)DAB顯色，觀察陽性細胞，用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機選取10個視野，在光密度和放大倍數(shù)一致的條件下，光鏡下統(tǒng)計得到陽性染色面積占選定分析總面積的比值，取其均值。

1.4.5 HE染色行心肌病理

將固定好的標本乙醇脫水，石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片，行HE染色，光鏡下拍片并觀察心肌病理變化。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 模型建立情況

分別選取并處死2只模型兔, 1只正常兔，取腹主動脈。觀察主動脈病變分布情況:模型組腹主動脈內(nèi)膜有許多黃白色或橙紅色條紋凸起,甚至大部分被斑塊覆蓋，正常組無病變。

2.2 CONR對DA兔心臟重量、左心室重量、心體比、左心室/體質(zhì)量指數(shù)的影響

結(jié)果示:與正常組比較,模型兔左心室重量(LCW)、心臟重量(CW)、左心室 /體質(zhì)量指數(shù)(LC/W)、心體比(C/W)增加(P<0.05)。CONR大、中劑量組能降低DA大兔LCW、CW、C/W、LC/W。 詳見圖1，圖2。

圖1 CONR對DA兔CW、LCW的影響注：與正常組比較,*P<0.05；與模型組比較,△△P<0.01，△P<0.05

圖2 CONR對DA兔C/W、LC/W的影響注：與正常組比較,*P<0.05；與模型組比較,△△P<0.01，△P<0.05

2.3 CONR對DA兔肌組織 AngⅡ、Na+-K+-ATPase表達的影響

模型兔心肌組織AngⅡ含量明顯升高(P<0.01),心肌Na+-K+-ATPase活性明顯下降(P<0.01)。治療組各組均能減少DA大兔心肌AngⅡ含量(P<0.01),提高DA大兔心肌Na+-K+-ATPase活性(P<0.01)。詳見圖3。

圖3 CONR對DA兔AngⅡ、Na+-K+-ATPase的影響注：與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△△P<0.01，△P<0.05

2.4 CONR對DA大兔心肌ACE的影響

DA模型兔心肌ACE受體呈現(xiàn)高表達狀態(tài)(P<0.01)。CONR能顯著抑制DA大兔心肌ACE受體表達(P<0.01或P<0.05)。詳見圖4,圖5。

圖4 CONR對DA兔ACE的影響注：與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△△P<0.01，△P<0.05

圖5 對DA兔心肌組織ACE的影響免疫組化圖

2.5 CONR對DA大兔主動脈病理的影響

模型組心肌細胞腫脹變性，水腫明顯，細胞質(zhì)內(nèi)有大量的空泡形成，心肌間質(zhì)纖維結(jié)構紊亂。CONR高、中劑量組及辛伐他汀組心肌細胞水腫、炎性細胞浸潤、心肌間質(zhì)纖維排列紊亂增生等病理改變得到改善。詳見圖6。

圖6 各組大兔心肌標本HE染色(400×)標尺：20 μm

3 討論

高糖環(huán)境加速AGEs形成，AGEs與RAGE結(jié)合在心肌組織中形成交聯(lián)結(jié)構，使各種酶敏感性下降、動脈硬化，從而心肌收縮/舒張功能異常。既往研究[5]結(jié)果顯示：CONR能抑制體內(nèi)糖基化過程，減少糖基化終產(chǎn)物的生成從而減少2型糖尿病心肌缺血。

AGEs[1]可以激活局部RAS系統(tǒng)導致糖尿病大鼠冠狀動脈結(jié)構和功能改變。本實驗DA大兔心肌AngⅡ含量明顯升高，ACE受體表達明顯升高，表明DA心臟局部RAS的激活。心肌局部AngⅡ增高，可以引起血管收縮和平滑肌細胞增殖，刺激心肌成纖維細胞增生，膠原代謝紊亂，加速心肌損害，影響心臟舒縮功能[20]。

本實驗研究結(jié)果顯示：治療組各組均能明顯抑制AngII含量，抑制ACE受體的表達，延緩糖尿病大兔心肌肥厚的進程，改善心臟收縮和舒張功能，從而達到治療DA兔心肌損傷的目的。

Na+-K+-ATP酶可使ATP發(fā)生水解，保持細胞內(nèi)高鉀和細胞外高鈉，對維持細胞內(nèi)外離子梯度，膜興奮性及細胞新陳代謝等生物功能的變化具有重要作用。高血糖條件下，機體產(chǎn)生的大量ROS可以通過AGEs引起Na+-K+-ATPase酶活性降低，誘發(fā)心肌損傷，導致糖尿病動脈粥樣硬化的產(chǎn)生與發(fā)展。

中醫(yī)理論認為消渴病及其并發(fā)癥的主要病機是陰虛燥熱兼有血瘀。我們結(jié)合現(xiàn)代藥理研究，以滋陰清熱、活血祛瘀為治則創(chuàng)立了冬連三七組分。在前期4項國自然研究中,應用先進技術使麥冬多糖，三七總皂甙及黃連生物堿的提純含量達到90%以上,麥冬多糖40%,黃連生物堿30%,三七總皂甙30%是經(jīng)過反復測驗得到的最佳配比方案。

本次研究結(jié)果顯示，CONR可顯著降低DA大兔左心室重量、心臟重量、左心室/體質(zhì)量指數(shù)、心體比，提高DA兔心肌Na+-K+-ATPase活性，減少心肌組織AngⅡ含量,并抑制心肌ACE受體表達；CONR明顯改善了DA兔心肌細胞水腫、炎性細胞浸潤、心肌間質(zhì)纖維排列紊亂增生等病理改變。

綜上，CONR可能通過抑制AGEs產(chǎn)生，減輕RASS系統(tǒng)激活,提高Na+-K+-ATPase酶活性從而改善DA兔的心肌損傷。