吳建紹，朱志煌，李雷斌，楊求華，鐘建興，方民杰，陸 振

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361013)

雙斑東方鲀(Fugubimaculatus)隸屬于鲀科(Tetraodontidae)，東方鲀屬(Takifugu)，為近海暖溫性底層魚(yú)類(lèi)，其肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美，被譽(yù)為“魚(yú)中之王”，為福建省當(dāng)?shù)靥厣酿B(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)品種之一，已在福建沿海規(guī)模化養(yǎng)殖[1-2]。目前雙斑東方鲀養(yǎng)殖主要以池塘混養(yǎng)和網(wǎng)箱養(yǎng)殖為主，循環(huán)水養(yǎng)殖技術(shù)正在該品種的養(yǎng)殖中應(yīng)用和推廣。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(Recirculating aquaculture system，RAS)技術(shù)主要對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程的技術(shù)參數(shù)進(jìn)行有效控制、養(yǎng)殖水體重復(fù)循環(huán)利用和廢水高效處理，因其集約型、高投入和高產(chǎn)出、可持續(xù)利用的特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚(yú)類(lèi)生產(chǎn)[3-4]。但是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)是個(gè)封閉的循環(huán)系統(tǒng)，一旦循環(huán)水養(yǎng)殖池部分魚(yú)體發(fā)生病原菌病害，就容易造成同一病害在循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi)蔓延，導(dǎo)致整個(gè)系統(tǒng)養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)交叉感染，引發(fā)該疾病大規(guī)模爆發(fā)，從而導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)死亡，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前有學(xué)者報(bào)道在循環(huán)水養(yǎng)殖大菱鲆和半滑舌鰨過(guò)程中有常見(jiàn)細(xì)菌性疾病發(fā)生，且死亡嚴(yán)重[5-6]；本研究在雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌性病害發(fā)生。因細(xì)菌性病害的發(fā)生、流行與養(yǎng)殖水體的微生物群落息息相關(guān)[7]，所以有必要了解雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體微生物群落特征，并進(jìn)行魚(yú)體健康時(shí)與患病時(shí)的養(yǎng)殖水體微生物群落特征比較，探討?zhàn)B殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)與魚(yú)體健康狀況之間的關(guān)系，以便于更好地利用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖雙斑東方鲀，防止細(xì)菌性病害發(fā)生。

本研究通過(guò)16S rRNA高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，比較了雙斑東方鲀健康時(shí)與患病時(shí)的養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征與差異。本研究結(jié)果可為雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖細(xì)菌性病害預(yù)警、預(yù)防及管理控制提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集和處理

1.1.1 試驗(yàn)場(chǎng)地與水樣采集

福建省海水魚(yú)類(lèi)苗種繁育科研中試基地試驗(yàn)應(yīng)用雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖，養(yǎng)殖方式為每套循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(同型號(hào))各自管理一口養(yǎng)殖池。2016年6—7月，其中一口循環(huán)水養(yǎng)殖池大部分雙斑東方鲀發(fā)生皮膚潰瘍病，病魚(yú)特征為游動(dòng)緩慢，停止攝食，口角、表皮潰爛、鰭條缺損潰爛，潰爛處周邊皮膚發(fā)紅，腎臟、脾臟充血腫大，部分雙斑東方鲀出現(xiàn)死亡(圖1)。從患潰瘍病的循環(huán)水養(yǎng)殖池(編號(hào)1#)和健康養(yǎng)殖池(編號(hào)2#)隨機(jī)采集養(yǎng)殖水體樣品(5 L)，每池分5個(gè)位點(diǎn)取樣，每個(gè)位點(diǎn)取1 L水樣，然后混勻成一個(gè)樣品。樣品采集后立即低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并用直徑為0.22 μm的聚醚砜膜及時(shí)抽濾。將濾膜(帶有水樣宏基因組)保存于-80℃，用于提取宏基因組DNA。

1.1.2 患潰瘍癥的雙斑東方鲀病原確認(rèn)

將患潰瘍癥的雙斑東方鲀病魚(yú)帶回實(shí)驗(yàn)室。用滅菌海水清洗病魚(yú)體表，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)從病魚(yú)潰爛部位、脾、腎等組織取樣并在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和TCBS平板做細(xì)菌劃線分離培養(yǎng)、純化，分離出優(yōu)勢(shì)菌DJ1#，其在TSB平板上為半透明、圓形、邊緣整齊的黃色菌落。結(jié)合病癥特征，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA基因序列分析，顯示DJ1#為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)。采用背肌注射1×108CFU/mL優(yōu)勢(shì)菌DJ1#懸液感染健康的雙斑東方鲀，注射劑量為0.2 mL/尾；對(duì)照組注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水。經(jīng)人工感染后，雙斑東方鲀發(fā)病的主要癥狀與循環(huán)水養(yǎng)殖病魚(yú)癥狀相似(圖2)，從感染后病魚(yú)體表病灶、脾、腎等部位均能分離到與原致病菌形態(tài)、特征一致的菌株，確定該菌可導(dǎo)致雙斑東方鲀患相同潰瘍癥癥狀(另文報(bào)道)。患潰瘍癥的雙斑東方鲀致病原確認(rèn)為哈維氏弧菌。

1.2 水樣宏基因組提取和菌群的Miseq高通量測(cè)序

宏基因快速提取試劑盒由上海生物工程技術(shù)公司提供，水樣宏基因組提取操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA保守序列設(shè)計(jì)引物：正向引物338F5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和反向引物806R5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，然后定量并質(zhì)檢、測(cè)序。Miseq高通量測(cè)序由美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(上海)完成。

1.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)所測(cè)得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜、拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后利用Qiime軟件，將相似度大于97%的一致性序列聚類(lèi)成1個(gè)操作分類(lèi)單元(Operational taxonomic unit，OTU)，統(tǒng)計(jì)各樣品所含OTU的數(shù)量，去除無(wú)法分類(lèi)的OTU，并用R語(yǔ)言工具和作圖軟件繪制稀疏曲線、Venn圖；基于物種豐度的分析：應(yīng)用Mothur軟件進(jìn)行多樣性指數(shù)(Alpha)分析，計(jì)算物種豐富度指數(shù)(Chao和Ace)、覆蓋率(Coverage)和多樣性指數(shù)(Shannon)等，分析各多樣性指數(shù)間的差異；基于群落結(jié)構(gòu)分析：采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并在門(mén)、綱、目、科和屬等分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)樣品的物種豐度和分布。

2 結(jié)果

2.1 樣品高通量序列數(shù)據(jù)結(jié)果

患病的(1#)和健康的(2#)2個(gè)養(yǎng)殖水體樣品獲得的有效序列條數(shù)分別為66 507、53 823，序列的平均長(zhǎng)度在450 bp左右，符合測(cè)序要求(表1)。從樣品稀釋曲線看，稀釋曲線總體趨勢(shì)為：在<10 000條序列時(shí)，OTU數(shù)量隨著樣品的序列數(shù)增加而迅速增加；在10 000～30 000條序列時(shí)，OTU數(shù)目增加緩慢；之后則趨于平臺(tái)期(圖3)；說(shuō)明2個(gè)樣品測(cè)序飽和，可覆蓋樣品中大部分OTU，數(shù)據(jù)可靠?；疾〉?1#)和健康的(2#)養(yǎng)殖水體樣品中OTU數(shù)目分別為435和422個(gè)，共有OTU數(shù)為402個(gè)，各自特有OTU數(shù)分別為33和20個(gè)；Venn圖的結(jié)果表明，患病的(1#)和健康的(2#)養(yǎng)殖水體菌落組成有90%以上重疊，二者菌落種類(lèi)組成相似度高(表1，圖3)

表1 樣品高通量測(cè)序結(jié)果

2.2 循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)分析

從表2中可以看出，2個(gè)樣品的覆蓋率都在99%以上，患病的(1#)養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落物種豐富度指數(shù)(Chao和Ace)分別為446.00、449.98，多樣性指數(shù)(Shannon)為3.74；健康的(2#)養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落物種豐富度指數(shù)(Chao和Ace)分別為448.56、451.71，多樣性指數(shù)(Shannon)為3.46?；疾〉暮徒】档碾p斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落各多樣性指數(shù)數(shù)值接近，無(wú)較大差別。

表2 循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)

2.2.2 養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

根據(jù)OUT物種序列分類(lèi)注釋結(jié)果，雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體在各分類(lèi)水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成如下：在門(mén)水平上，細(xì)菌群落由變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidete)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)等多個(gè)菌門(mén)組成，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)；在綱水平上，細(xì)菌群落由γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)等多個(gè)菌綱組成，優(yōu)勢(shì)菌綱為γ-變形菌綱、黃桿菌綱、α-變形菌綱；在目水平上，細(xì)菌群落由黃桿菌目(Flavobacteriales)、硫發(fā)菌目(Thiotrichales)、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)、交替單胞菌目(Alteromonadales)、弧菌目(Vibrionales)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)等多個(gè)菌目組成，優(yōu)勢(shì)菌目為黃桿菌目、硫發(fā)菌目、紅細(xì)菌目、交替單胞菌目、弧菌目；在科水平上，細(xì)菌群落由黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、硫發(fā)菌科(Thiotrichaceae)、紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、交替假單胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)等多個(gè)菌科組成，優(yōu)勢(shì)菌科為黃桿菌科、硫發(fā)菌科、紅細(xì)菌科、弧菌科、交替假單胞菌科(表3)。在各分類(lèi)水平上都是由少數(shù)幾種細(xì)菌種群占絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位，表明循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落構(gòu)成比較簡(jiǎn)單。

患病的(1#)和健康的(2#)養(yǎng)殖水體在各分類(lèi)水平上細(xì)菌群落豐度占比如表3所示，二者在各分類(lèi)水平上的細(xì)菌群落組成基本相似，但同一分類(lèi)水平下的各細(xì)菌群落豐度占比明顯不同，特別是在各自優(yōu)勢(shì)門(mén)、綱、目、科等的種群菌落豐度占比差異大(表3)。

表3 循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落在各級(jí)分類(lèi)水平上的豐度占比

續(xù)表3

2.2.3 養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落核心微生物屬水平的結(jié)構(gòu)組成

在核心微生物(屬)的分類(lèi)水平上，雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌種類(lèi)主要由Polaribacter屬、Leucothrix屬、粘著桿菌屬(Tenacibaculum)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)等250多個(gè)屬組成。表4為健康的和患病的養(yǎng)殖水體各主要菌屬豐度占比，其中健康的養(yǎng)殖水體核心菌屬為Polaribacter(34.92%)、Leucothrix(10.48%)、粘著桿菌屬(6.61%)、假交替單胞菌屬(5.28%)；患病的養(yǎng)殖水體核心菌屬為發(fā)光桿菌屬(16.95%)、弧菌屬(15.05%)、Leucothrix(12.19%)、Polaribacter(9.32%)、假交替單胞菌屬(7.19%)。二者核心菌屬豐度差異十分明顯，特別是患病的養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落以弧菌科的發(fā)光桿菌屬和弧菌屬為主，而發(fā)光桿菌屬和弧菌屬多數(shù)屬于與魚(yú)病有關(guān)的病原菌或條件致病菌。

表4 循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落在屬水平上的豐度占比

3 討論

3.1 循環(huán)水養(yǎng)殖水體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征情況

循環(huán)水養(yǎng)殖是一種現(xiàn)代化的高密度精養(yǎng)模式，其不受自然條件限制，生產(chǎn)管理可控，養(yǎng)殖用水可循環(huán)利用，系統(tǒng)運(yùn)作高效、節(jié)能、環(huán)保，目前廣泛應(yīng)用于鲆鰈類(lèi)[8]、石斑魚(yú)類(lèi)[9]和東方鲀類(lèi)[10]等魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖。循環(huán)水養(yǎng)殖水體中微生物情況與養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、健康密切相關(guān)，其群落結(jié)構(gòu)指示著魚(yú)體身體健康變化情況。有關(guān)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究一直備受關(guān)注，李秋芬等[11]利用PCR-DGGE分析了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池細(xì)菌群落特征，發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為其優(yōu)勢(shì)菌群；陳珠[10]研究了紅鰭東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池微生物多樣性，結(jié)果是優(yōu)勢(shì)菌群為γ-變形菌綱、α-變形菌綱和擬桿菌門(mén)；吳越等[12]研究了石斑魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)特征，研究結(jié)果是優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)；Martins等[13]研究大菱鲆和塞納加爾鰨循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門(mén)。本研究對(duì)雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖水體細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，結(jié)果是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，且在各分類(lèi)水平(門(mén)、綱、目、科、屬)上都是由少數(shù)幾種細(xì)菌種群占絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位，細(xì)菌群落構(gòu)成較單一。以上研究均說(shuō)明雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢(shì)菌群構(gòu)成簡(jiǎn)單，表明可通過(guò)幾種優(yōu)勢(shì)菌群種類(lèi)來(lái)管理和控制循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，通過(guò)優(yōu)勢(shì)菌群管理循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)更有利于其健康、高效運(yùn)作。

3.2 患病和健康的雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異

本研究中患潰瘍癥的雙斑東方鲀致病原為哈維氏弧菌，哈維氏弧菌可通過(guò)表皮的創(chuàng)傷或口腔感染魚(yú)體，是海水中常見(jiàn)的條件致病菌，能導(dǎo)致多種養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)大量死亡[14-16]。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究比較患哈維氏弧菌病的和健康的雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)二者核心菌屬豐度差異明顯，患病的養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落以弧菌科的發(fā)光桿菌屬和弧菌屬為主，而發(fā)光桿菌屬和弧菌屬多數(shù)屬于與魚(yú)病有關(guān)的病原菌或條件致病菌，特別是患病的養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的弧菌屬豐度占比高，是健康的養(yǎng)殖水體的15倍(表4)；許多弧菌屬種類(lèi)或菌株具有多種毒力因子的胞外產(chǎn)物和外毒素[17-19]，可引起多種海洋動(dòng)物出現(xiàn)皮膚潰瘍、爛鰭、爛尾、出血等癥狀[20]，由此表明雙斑東方鲀患潰瘍癥與養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的弧菌屬豐度占比高有關(guān)。而侯婷婷等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)患弧菌病的青石斑魚(yú)養(yǎng)殖池養(yǎng)殖水體核心微生物以弧菌等病原菌或?qū)︷B(yǎng)殖動(dòng)物不利的屬為主，且與健康養(yǎng)殖池細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，從而推斷患病是由弧菌導(dǎo)致的。通過(guò)對(duì)患病和健康的雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異比較，其結(jié)果可為雙斑東方鲀循環(huán)水養(yǎng)殖病害發(fā)生提供預(yù)警和診斷。

3.3 循環(huán)水養(yǎng)殖細(xì)菌性病害發(fā)生問(wèn)題

近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)利用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)仍有細(xì)菌性病害發(fā)生，一方面系統(tǒng)多個(gè)環(huán)節(jié)包括養(yǎng)殖池、生物濾池、弧形篩、曝氣池等仍存在大量病原菌的可能[21]；另一方面循環(huán)水養(yǎng)殖的高密度特性，一旦系統(tǒng)超出魚(yú)類(lèi)生物承載量，易造成養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)爭(zhēng)食、撕咬、機(jī)體損傷等，引起繼發(fā)性疾病暴發(fā)，例如雙斑東方鲀具有鋒利板齒和好斗貪食特性，彼此會(huì)互相攻擊，易造成外傷引發(fā)繼發(fā)性細(xì)菌病發(fā)生。目前循環(huán)水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病的主要致病菌以弧菌科為主[22]，其疾病的發(fā)生、流行與養(yǎng)殖水體的微生物群落息息相關(guān)；弧菌又容易在TSB平板生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作方便，所以可以將弧菌作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)對(duì)其預(yù)警監(jiān)測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所取樣的患潰瘍病循環(huán)水養(yǎng)殖池(編號(hào)1#)和健康養(yǎng)殖池(編號(hào)2#)前期養(yǎng)殖密度和管理相同，但循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)是技術(shù)和設(shè)備高度集成的系統(tǒng)工程，每個(gè)環(huán)節(jié)及上下游的處理需嚴(yán)密協(xié)作，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)小的失誤(包括病害發(fā)生)都會(huì)嚴(yán)重影響整體養(yǎng)殖效果，所以會(huì)出現(xiàn)二者區(qū)別。為了更好地預(yù)防循環(huán)水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性病害的發(fā)生，首先要加強(qiáng)科學(xué)管理，加強(qiáng)各環(huán)節(jié)污物清除，工具和池體及時(shí)浸泡消毒，可以減少細(xì)菌滋生溫床；其次要提高養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)機(jī)體的免疫力，控制養(yǎng)殖生物承載量，盡量減少養(yǎng)殖魚(yú)體表?yè)p傷；最后要加強(qiáng)養(yǎng)殖水體致病菌(弧菌)監(jiān)測(cè)和控制。

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