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(浙江理工大學生命科學學院，杭州 310018)

0 引 言

黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)是屬于黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員，作為模式病毒已用于病毒致病性、病毒與寄主互作和病毒進化等方面的研究[1]。CMV是一種經濟型重要的植物病毒，能侵染近1000種植物[2-3]。CMV是一種正義單鏈RNA病毒，其基因組是由三條正義單鏈RNA組成，按照大小依次命名為RNA1、RNA2和RNA3。CMV基因組每條RNA鏈的5’-端均具有帽子結構，且3’-端具有類似tRNA的結構(tRNA-like structure，TLS)[4-5]。RNA1是單順反子，編碼具有甲基轉移酶結構域和解旋酶結構域的1a蛋白。RNA2編碼含RNA聚合酶活性的2a蛋白，并通過其亞基因組RNA4A編碼具有沉默抑制作用的2b蛋白[6-7]。CMV 1a和2a蛋白負責CMV的復制。免疫組化實驗顯示CMV 1a和2a蛋白定位于植物的液泡膜，由此推斷CMV的復制場所為液泡膜[8]。RNA3編碼兩個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，其5’端ORF編碼移動蛋白(Movement protein，MP)，負責病毒的胞間移動和長距離移動[9]。第二個ORF則通過其亞基因組RNA4編碼外殼蛋白(Coat protein，CP)，負責病毒基因組的包裝和參與病毒的長距離移動[10-11]。

植物內源的二羧酸-三羧酸鹽載體蛋白(Dicarboxylate-tricarboxylate carrier，DTC)定位于線粒體膜和液泡膜，負責二羧酸鹽和三羧酸鹽的跨膜轉運[12]，參與氨基酸的初步合成、脂肪酸的代謝和類異戊二烯的生物合成等代謝途徑[13-15]。擬南芥僅編碼1個DTC基因，而煙草則編碼4個DTC基因，分別為NtDTC1、NtDTC2、NtDTC3和NtDTC4[16]。目前關于DTC蛋白的功能研究較少，尚未見有關該蛋白參與生物脅迫的報道。為了探索DTC蛋白在病毒侵染方面的是否具有一定作用，本文通過煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)誘導的基因沉默和植物中瞬時過表達方法，分析本氏煙中NtDTC2下調表達與過表達對CMV編碼蛋白的積累量影響，初步確定NtDTC2在CMV侵染寄主中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

Q5超保真DNA聚合酶購于New England BioLabs公司、限制性內切酶購于Thermo Fisher Scientific公司、凝膠回收試劑盒及質粒小提試劑盒購于Axygen公司、RT-PCR試劑盒購于天根生物科技有限公司、eGFP抗體購于Santa Cruz biotechnology公司，常規(guī)生化試劑購于上海生工生物技術有限公司和Sigma貿易有限公司。

1.2 材料

本氏煙(Nicotianabenthamiana)幼苗于植物生長室中恒溫培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)，待幼苗培養(yǎng)至兩周以上用于農桿菌浸潤。

CMV基因組RNA1、RNA2、RNA3的侵染性克隆pCB301-R1、pCB301-R2和pCB301-R3為實驗室前期構建和保存，構建方法參考文獻[17]。增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, eGFP)替換2b ORF的侵染性克隆pCB301-R2-eGFP和eGFP替換CP ORF的侵染性克隆pCB301-R3-eGFP，由本實驗室構建和保存。病毒誘導的基因沉默載體pTRV-RNA1(TRV1)、pTRV-RNA2(TRV2)由清華大學劉玉樂教授實驗室提供。

1.3 植物總RNA提取

利用液氮將0.1 g葉組織研磨粉碎，然后加入1.0 mL RNA提取溶液(50 mmol/L pH值5.2 NaAC，10 mmol/L pH值8.0 EDTA 和1%SDS)，繼續(xù)研磨至勻漿。吸取勻漿至RNase-free的1.5 mL離心管中，加入等量的水飽和酚，渦旋混勻；在4 ℃，12000 r/min條件下離心6 min。之后吸取上清，按照3∶2的比例加入苯酚/氯仿混合液(1∶1混合)，渦旋混勻；在4 ℃，12000 r/min條件下離心6 min后，吸取上清，然后用3倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 mol/L NaAC (pH值5.2)沉淀RNA。最后，用DEPC水溶解RNA，利用Nanodrop測定所提RNA的濃度和純度。

1.4 質粒的構建

通過常規(guī)的克隆方法構建DTC2的VIGS沉默質粒。實驗方法為：利用oligo(dT)12作為反轉錄引物，逆轉錄合成本氏煙總RNA的cDNA，并用特異的引物進行PCR擴增。RT-PCR具體步驟根據天根生物科技有限公司RT-PCR試劑盒提供的說明。以合成的cDNA作為模板，利用VIGS引物對VIGS Nb-Dtc2 F/VIGS Nb-Dtc2 R(表1)擴增片段DTC2 VIGS，經過BamH I和SmaI消化后克隆至預先用相同限制性內切酶處理的載體pTRV2，經挑取單斑鑒定后提取質粒pTRV2-DTC2。構建瞬時過表達本氏煙DTC2的質粒p35S-DTC2。具體構建方法為：以本氏煙cDNA為模板，利用引物對Dtc2-OE-F/Dtc2-OE-R(表1)擴增DTC2全長編碼序列，經EcoRI和BamH I消化后克隆至預先用相同限制性內切酶處理的質粒p35S-Flag-HA，獲得重組克隆質粒p35S-DTC2。所有質粒需經序列測定以保證序列的準確性。質粒轉化農桿菌，挑斑鑒定后，保存于-80 ℃。

表1 構建質粒的引物序列

1.5 農桿菌浸潤接種

取50 μL保存于-80 ℃的農桿菌(含相應的質粒)于含有抗生素利福平(30 mg/L)、慶大霉素(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)的5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床，220 r/min的條件下培養(yǎng)16 h對菌種進行菌種活化和擴大培養(yǎng)，離心收集各個農桿菌的菌體，最后將菌液懸浮于浸潤緩沖液(10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和200 mmol/L乙酰丁香酮)中。利用分光光度計測量菌液在600 nm下的OD值，調整TRV1、TRV2-DTC2、TRV2菌液OD值為0.2，調整35S-DTC2、35S-Flag-HA、pCB301-R1、pCB301-R2、pCB301-R3、pCB301-R2-eGFP以及pCB301-R3-eGFP菌液OD值為0.5。按照TRV1與TRV2-DTC2、TRV1與TRV2的組合將菌液等體積混合。混合后的菌液于暗處放置2～3 h，通過注射器接種于4～5葉期本氏煙。CMV注射后5 d，在紫外燈下觀察GFP熒光，并拍照保存。

1.6 本氏煙總蛋白提取及Western blot檢測

從0.2 g葉組織中提取植物總蛋白，具體操作方法參考文獻[18]。蛋白樣品需經酶標儀定量后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。利用轉膜儀，在電壓100 V的條件下轉膜1 h，將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜。為了分析CMV編碼的eGFP的積累量，利用eGFP多克隆抗體進行蛋白雜交檢測。結合一抗和二抗后，分別在TBST中洗膜三次，每次10 min，之后在TBS中洗膜10 min。利用ECL檢測膜并通過X射線膠片的放射自顯影來顯現蛋白的特異性條帶。

2 結果與分析

2.1 pTRV2-DTC2重組克隆的構建

從本氏煙中提取植物總RNA，通過反轉錄得到本氏煙的cDNA，以cDNA為模板，利用VIGS Nb-Dtc2 F/VIGS Nb-Dtc2 R引物對擴增DTC2 VIGS的DNA片段，片段預期大小約300 bp。PCR產物的電泳結果如圖1(a)所示，PCR產物的擴增片段位于略高于250 bp條帶的位置處，其大小與預期片段大小相符。將PCR擴增獲得的目的DNA片段經BamH I和SmaI酶切，克隆至pTRV2載體，獲得pTRV2-DTC2重組質粒，其電泳結果如圖1(b)所示。重組質粒經PCR鑒定和測序，確定重組質粒含有目的片段的插入，且序列未見任何的突變。

圖1 pTRV2-DTC2質粒的構建

2.2 pDTC2-OE質粒的構建

以本氏煙的cDNA為模板，利用Dtc2-OE-F/Dtc2-OE-R引物對擴增DTC2的全長cDNA，片段大小約800 bp，PCR產物的電泳結果如圖2(a)所示。PCR擴增產物位于750～1000 bp條帶之間，與預期的片段大小相符。將PCR擴增獲得的DTC2-OE片段經限制性內切酶EcoRI和BamH I消化后，克隆至載體p35S-Flag-HA，獲得過表達重組質粒p35S-DTC2。電泳檢測質粒p35S-DTC2如圖2(b)所示，電泳圖顯示質粒p35S-DTC2的大小與預期相符。質粒經PCR檢測和序列測定，確定為含有目的片段的陽性克隆。

圖2 p35S-DTC2質粒的構建

2.3 TRV下調的DTC2 mRNA對CMV積累的影響

為了沉默本氏煙體內的DTC2 mRNA，將TRV1和TRV2-DTC2混合注射入本氏煙葉片，并以混合注射TRV1和TRV2作為陰性對照。注射后12 d，在注射葉的上部葉片接種CMVΔ2b-eGFP。接種病毒5 d后，在紫外燈下觀察各個處理的綠色熒光，結果如圖3所示。與陰性對照組TRV2處理的植株相比，CMVΔ2b-eGFP在TRV2-DTC2處理的葉組織中呈現更強的綠色熒光。在接種病毒后5 d，采取病毒接種葉，并提取其總蛋白；以Rubisco為二磷酸核酮糖氧合酶，作為植物內參蛋白用于確定蛋白的上樣量，通過Western blot檢測接種葉中eGFP的積累量，結果顯示：eGFP的積累量在TRV2-DTC2處理的葉組織中比對照組提高48%(圖4)，因此DTC2的下調表達促進CMV攜帶的eGFP蛋白的積累，初步說明DTC2對CMV侵染本氏煙具有負調控作用。

圖3 紫外燈下觀察DTC2下調后CMVΔ2b-eGFP病毒產生的GFP熒光

圖4 Western雜交檢測DTC2下調對后CMVΔ2b-eGFP病毒蛋白積累量

2.4 DTC2的過量表達對CMV積累的影響

為了進一步分析DTC2對CMV積累的負調控作用，本文通過農桿菌介導的瞬時過表達方法，測定DTC2的過表達對CMV積累的影響。在同一葉片上注射3個浸潤斑，分別為Mock(只接種浸潤緩沖液)、Vector(35S-Flag-HA)和35S-DTC2。浸潤3 d后，在原來的浸潤斑的位置接種CMVΔCP-eGFP，Mock組仍只接種浸潤緩沖液。病毒接種3 d后，在紫外燈下觀察綠色熒光的強度，結果如圖5所示。在Vector和35S-DTC2處理的區(qū)域均出現明顯的GFP綠色熒光，表明CMVΔCP-eGFP接種區(qū)域已有效地復制和翻譯。與對照Vector相比，過量表達DTC2蛋白的注射斑的綠色熒光相對較弱。病毒接種3 d后分別采取每個注射斑的葉片樣品，利用Western blot檢測eGFP的積累量。結果顯示，本氏煙中過量表達DTC2蛋白后，CMV攜帶的eGFP的積累量與對照組相比減少24%(圖6)，這表明DTC2對CMV確實具有一定的影響，進一步說明DTC2對CMV有一定的負調控作用。

圖5 紫外燈下觀察DTC2過表達對CMVΔCP-eGFP產生GFP熒光的影響

圖6 Western雜交檢測DTC2過表達對CMVΔCP-eGFP產生的GFP蛋白積累量的影響

3 討 論

就DTC蛋白的功能而言，除了跨膜轉運二羧酸鹽和三羧酸鹽的功能之外[15]，尚未有其它功能的報道。本文通過基因沉默和過表達本氏煙DTC2，初步確定DTC2負調控CMV的積累。寄主因子負調控病毒積累的途徑包括降低病毒RNA的翻譯和復制效率以及降低病毒RNA的體內穩(wěn)定性。擬南芥編碼的RNA結合蛋白APUM5通過結合CMV RNA的3’UTR，抑制病毒RNA的翻譯，從而負調控病毒的積累[19]。siRNA介導的抗病毒沉默是降低CMV RNA穩(wěn)定性的主要途徑，但是，CMV通過其編碼的RNA沉默抑制子2b蛋白競爭性地結合siRNA，能有效地抑制寄主的抗病毒RNA沉默[20-21]。由于本氏煙DTC2與CMV的復制場所均位于液泡膜，本氏煙DTC2可能參與調控CMV的翻譯或復制。除了寄主的蛋白因子之外，膜脂質也參與病毒的復制，并扮演重要的角色。磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine，PE)和卵磷脂(Phosphatidylcholine，PC)分別正調控番茄叢矮病毒(Tomatobushystuntvirus，TBSV)和雀麥花葉病毒(Bromemosaicvirus，BMV)的復制[22-23]。DTC介導的二羧酸鹽和三羧酸鹽的跨膜轉運能夠參與脂肪酸的代謝途徑[14-15]。因此，本氏煙DTC2的下調表達或過表達有可能影響植物體內脂質的合成代謝，從而間接地影響CMV的積累，關于DTC2調控CMV積累的分子機制仍有待進一步的研究。

4 結 論

本文通過構建DTC2的沉默載體以及過表達載體，在本氏煙中下調表達或過表達DTC2后，Western blot分析CMV編碼的GFP量的變化，主要結論如下：

a) 本氏煙DTC2下調表達促進CMVΔ2b-eGFP的積累；

b) 本氏煙DTC2過表達抑制CMVΔCP-eGFP的積累。

基于以上結果，初步確定本氏煙DTC2蛋白在植物中負調控CMV的積累，DTC2調控CMV侵染寄主植物的分子機制有待于進一步研究。