程廣超，楊 斌，王建禮，桂長莉

(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021)

雌性動物的動情周期分為動情前期(proestrus)、動情期(estrus)、動情后期(metestrus) 和動情間期(diestrus)，相應地外周血雌激素和孕激素水平也有一個周期的變化，二者在動情前期處于高峰水平[1]。受到卵巢雌激素和孕激素波動的影響，動情周期會影響雌性動物的行為和情緒。例如，雌性動物的性行為會隨動情周期變化，處于動情前期雌性大鼠的氣味對雄性最具吸引力，在動情間期最缺乏吸引力；小家鼠(Musmusculus)的配偶選擇也依賴于動情狀態(tài)[2]。動情前期小鼠和大鼠的空間記憶或物體識別能力比動情期和動情間期高[3-4]。動情間期雌性大鼠的焦慮水平和抑郁水平高于動情前期及動情期[5-6]，并且一些藥物的抗抑郁效應也由此與動情周期有關[7]。應激系統(tǒng)特別是下丘腦-垂體-腎上腺 (hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)軸對調控動物行為及情緒至關重要。雌激素可以調節(jié)HPA軸對應激的反應[8]。在HPA軸調節(jié)的應激反應中，海馬糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)是一個關鍵位點，主要通過與皮質酮(corticosterone，CORT)結合調節(jié)應激反應。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是兒茶酚胺的限速酶，它標記的神經元包括多巴胺(dopamine,DA)和去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)。在神經遞質中DA和NE被公認為參與動機活動的調節(jié)，與情緒和獎賞有關[9-10]。本試驗主要比較了動情期和動情間期CORT水平以及海馬中GR神經元和獎賞相關腦區(qū)中TH神經元的免疫活性，以期進一步探討動情周期影響雌性動物行為改變的神經內分泌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雌性ICR小鼠，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。飼養(yǎng)于塑料飼養(yǎng)籠(32×21.5×17 cm3)，每籠4只，木屑做墊料，飼料和飲水充足。室溫25℃，光照周期12 L∶12D，食物、飲水充足。室內適應飼養(yǎng)2周后，開始試驗，實驗動物分為2組，動情期組(n=6)和動情間期組(n=6)。

1.1.2 主要儀器及試劑 冷凍切片機，德國Leica公司生產；小鼠血清雌二醇(estradiol，E2)和CORT酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，蘇州卡爾文科技公司產品；TH兔抗多克隆抗體，英國Abcam公司產品；GR兔抗多克隆抗體，美國Santa Cruz公司產品，中杉金橋生物技術有限公司分裝；SABC試劑盒和DAB顯色劑，武漢博士德生物工程有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動情周期的檢測 用陰道上皮細胞亞甲基藍染色法檢測動情周期。移液槍吸15 μL生理鹽水，對小鼠陰道進行反復沖洗。將含有陰道脫落細胞的液體涂抹到載玻片上，干燥，用10 mg/mL亞甲基藍染色。動情前期涂片顯示的主要是有核上皮細胞，偶有少量角化細胞；動情期涂片中則是無核角化細胞或偶有少量上皮細胞；動情后期出現(xiàn)有核上皮細胞、無核上皮細胞和白細胞；動情間期的涂片中存在大量的白細胞(圖1)。

A.動情前期;B.動情期;C.動情后期;D.動情間期;NEC.有核上皮細胞;NNEC.無核上皮細胞;WBC.白細胞

A.Proestrus;B.Estrus;C.Eetestrus;D.Diestrus;NEC.Nucleated epithelial cell;NNEC.Non nuclear epithelial cell;WBC.White blood cell

圖1雌性ICR小鼠陰道上皮細胞亞甲基藍染色結果(比例尺=400 μm)

Fig.1 Vascular epithelial cells of female ICR mice stained with methylene blue(Bar=400 μm)

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢側 動物經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉。通過心臟采血收集血液樣本，樣本收集20 min后離心，血清在測定前貯存于-20℃冰箱中。通過小鼠血清E2和CORT酶聯(lián)免疫試劑盒檢測，檢測方法遵循酶聯(lián)免疫試劑盒使用說明書。

1.2.3 免疫組織化學染色 動物麻醉后先用40 mg/mL多聚甲醛進行灌注固定，取出腦組織放入40 mg/mL多聚甲醛后固定過夜(4℃)，其后4℃下置于300 g/L蔗糖溶液直至組織沉底。用冷凍切片機將腦切片，片厚40 μm。用山羊血清封閉液37℃濕盒內封閉1 h。滴加由抗體稀釋液稀釋的一抗：TH(1∶1 000)和GR(1∶100)4℃孵育72 h。0.01 mol/L PBS漂洗5 min,漂洗3次。滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃濕盒內孵育1.5 h。0.01 mol/L PBS漂洗5 min,漂洗3次。滴加SABC試劑，37℃濕盒內孵育2.5 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min,漂洗4次。DAB顯色劑顯色。常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

各腦區(qū)參照文獻[11]。每只鼠的各核團選擇3張連續(xù)的切片量化，利用顯微測微尺，計算相同面積內單側腦區(qū)核團的陽性神經元數(shù)目，包括海馬CA1、CA2/3和齒狀回(Dental gyrus，DG)的GR表達以及中腦腹側被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)、下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)和黑質網狀部(substantia nigra reticular part，SNr)的TH表達。

1.2.4 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。One-sample Kolmogorov-Smirnov檢測數(shù)據(jù)正態(tài)性。獨立樣本t檢驗分析組間差異。顯著性水平為P<0.05。

2 結果

2.1 血清E2和CORT水平

與動情間期的雌性小鼠相比，動情期雌性小鼠的血清E2濃度顯著增加(P<0.01)(圖2)，但CORT濃度無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

2.2 GR-IR和TH-IR神經元的表達

與動情間期的雌性小鼠相比，動情期雌性小鼠在海馬CA1(P<0.01)和DG(P<0.05)具有更多的GR-IR神經元，但CA2/3的GR-IR神經元數(shù)量無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

與動情間期組相比，動情期的PVN內TH-IR神經元數(shù)量顯著增加(P<0.05)；經檢驗兩組VTA的TH-IR樣本方差不具有同質性(P<0.05)，動情期VTA內TH-IR神經元數(shù)量顯著增加(P<0.05)；SNr腦區(qū)內TH-IR神經元數(shù)量差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

動情期和動情間期雌性ICR小鼠GR和TH免疫組織化學染色情況見圖5。

圖2 動情期和動情間期雌性ICR小鼠血清E2 和CORT的濃度

圖3 動情期和動情間期雌性ICR小鼠GR-IR神經元的數(shù)量

PVN.下丘腦室旁核；VTA.中腦腹側被蓋區(qū)；SNr.黑質網狀部

PVN.Paraventricular nucleus;VTA.Ventral temental area;SNr.Substantia nigra reticular part

圖4動情期和動情間期雌性ICR小鼠TH-IR神經元的數(shù)量

Fig.4 The number of TH-IR neurons in female ICR mice in estrus and diestrus

A、C、E.動情期；B、D、F.動情間期；DG.齒狀回；PVN.下丘腦室旁核；VTA.中腦腹側被蓋區(qū)

A,C,E.Estrous;B,D,F.Diestrous;DG.Dentate gyrus;PVN.Paraventricular nucleus;VTA.Ventral temental area

圖5動情期和動情間期雌性ICR小鼠GR(A，B)和TH(C，D，E，F(xiàn))免疫組織化學染色結果(比例尺=100 μm)

Fig.5 GR (A and B) and TH(C, D, E and F) immunopositive staining in estrus and diestrus female ICR mice(Bar =100 μm)

3 討論

雌性小鼠在卵巢表現(xiàn)出周期性排卵、雌激素水平表現(xiàn)出周期性變化的同時，其陰道細胞也呈現(xiàn)出周期性變化，因而可通過陰道細胞的變化判斷其動情周期。動情前期和動情期是卵巢排卵期，動情后期是分泌孕酮及黃體形成的時期。本試驗結果表明，動情期雌性ICR小鼠的血清E2濃度高于動情間期。這已在許多實驗動物得到證實，例如，雌性大鼠的雌激素水平在動情期最高[12]，恒河猴(Rhesusmacaques) 在排卵期時雌激素水平最高[13]。有研究認為,雌激素能直接或間接地調節(jié)HPA軸的活性[14]。雌二醇可以刺激腎上腺皮質細胞分泌CORT，摘除卵巢可降低應激誘導的HPA軸反應水平，再給予雌激素后，可恢復正常水平[15]。本試驗中盡管動情期和動情間期血清E2水平有明顯差異，但CORT水平沒有顯著性差異。這與一些研究發(fā)現(xiàn)相似，例如，盡管動情前期雌性大鼠的CORT水平比動情間期高，但動情期和動情間期沒有差異[16]。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)動情期小鼠海馬CA1和DG的GR-IR表達高于動情間期。海馬是GR含量最高的腦區(qū)，主要參與對HPA軸的負反饋抑制，應激狀態(tài)下過量的糖皮質激素(glucocorticoid,GC)與海馬的GR結合，使海馬發(fā)出負反饋指令，抑制促腎上腺皮質激素釋放因子(corticotropic-releasing factor，CRF)的過度釋放，從而抑制HPA軸過度激活，降低體內過高的GC水平，使機體的激素水平維持穩(wěn)態(tài)。因此，海馬GR的激活對于減少CORT、焦慮和應激至關重要[17]。本試驗中動情期小鼠海馬GR-IR神經元的高水平表達意味著GR參與了對CORT的反饋調節(jié)，盡管沒有檢測到CORT水平的變化，但它可能是對動情前期CORT水平升高響應的延續(xù)；也可能是動情期升高的雌激素水平間接地調節(jié)了海馬GR的升高[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)動情期PVN的TH-IR神經元表達高于動情間期。PVN參與對應激反應的調節(jié)[19]。血液中雌激素的波動會引起腦區(qū)兒茶酚胺水平的改變。丘腦兒茶酚胺減少能夠抑制排卵。TH是兒茶酚胺的限速酶，PVN中TH升高更多地與NE釋放有關[20]。應激引起生理變化時，NE會升高，因此，它伴隨著HPA軸的活動而改變。盡管SNr的TH-IR神經元的表達沒有明顯差異，但VTA在動情期較動情間期有更多的TH-IR神經元。VTA可以影響動物的社會行為。獎賞是促進動物行為表達的基礎，實現(xiàn)天然獎賞的主要神經通路是中腦-邊緣-皮質多巴胺系統(tǒng)(mesocorticolimbicdopamine system,MCLDS)。在MCLDS通路中，DA能神經元的胞體主要位于VTA，VTA能夠產生DA[21]，VTA中TH免疫活性的升高意味動情期較動情間期合成了或釋放了更多的DA。DA有效地刺激促卵泡激素釋放因子(follicle stimulating hormone releasing factor,FRF)分泌和黃體生成激素釋放因子(Iuteinizing hormone releasing factor,LRF)釋放[22]，LRF可促進排卵。也有研究發(fā)現(xiàn),E2通過DA能神經元減少黃體生成素(Iuteinizing hormone,LH)的脈沖頻率會引起母羊不動情。長期注射DA受體拮抗劑舒必利(sulpiride)會誘導不動情的母馬和母羊排卵[23]。這些試驗暗示DA可從下丘腦-垂體-性腺((hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG)軸的上游和下游調節(jié)動情狀態(tài)和排卵。研究表明,雌激素對VTA的DA能神經元活動有調制作用，動情期的大鼠DA神經元放電頻率增加[24]。因此，動情期VTA中TH免疫活性的增加，可能受到E2升高的影響，通過影響TH的活性，雌激素可以調制DA介導的行為。

總之，在動情期和動情間期雌性ICR小鼠海馬GR神經元及PVN和VTA的TH神經元免疫活性不同。由于應激系統(tǒng)及兒茶酚胺在動物的行為和情緒中具有重要作用，因此，本試驗的結果有助于進一步解釋動情周期對雌性相關行為的影響。