唐 婕，李晶晶，王 波，索麗娟，王 艷*，嚴(yán)興榮*

(1.陜西省動(dòng)物研究所, 陜西西安 710032;2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陜西省西部資源與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710069;3.陜西省野生動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710069)

林麝是我國(guó)特有的能產(chǎn)麝香的野生動(dòng)物。麝香僅雄性林麝產(chǎn)生，其生殖器和肚臍之間有一個(gè)產(chǎn)麝香的香囊。麝香是名貴中藥材，是多種傳統(tǒng)中藥方劑的主要原料。為了獲取麝香，林麝遭到肆意捕殺，數(shù)量急劇減少，被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。林麝一年發(fā)情一次，主要集中在秋冬季節(jié)，雌麝這個(gè)時(shí)期錯(cuò)過(guò)交配機(jī)會(huì)或空懷，則需等到第二年發(fā)情期。因此，早期林麝妊娠診斷可充分利用林麝現(xiàn)有種質(zhì)資源，減少空懷數(shù)量，進(jìn)行大量繁育。目前，還沒(méi)有有效的林麝早期妊娠診斷方法，雖有研究報(bào)道，但均處于研究階段。早期妊娠診斷在人類醫(yī)學(xué)上已經(jīng)成熟，如利用超聲和試紙條技術(shù)，胎兒在4周末出現(xiàn)點(diǎn)狀的囊腔結(jié)構(gòu)，6周可出現(xiàn)胎兒的心跳搏動(dòng)，所以超聲診斷在人妊娠診斷中準(zhǔn)確度較高的時(shí)期是第6周[1]。牛的超聲早期妊娠診斷可在28 d～30 d就可用胚囊環(huán)和胎兒心跳進(jìn)行確診，也可通過(guò)直腸觸摸的方式鑒定是否妊娠[2]。羊的妊娠診斷很少用超聲診斷方法[3]。一般的羊場(chǎng)數(shù)量較多，用超聲的方法操作難度大，通過(guò)試情的方法，觀察動(dòng)物返情情況，根據(jù)返情行為推測(cè)其是否妊娠[4]。野生動(dòng)物早期妊娠診斷的研究報(bào)道較少，圈養(yǎng)野生動(dòng)物有用超聲診斷的報(bào)道，但報(bào)道較少[5]。除了超聲診斷，通過(guò)妊娠相關(guān)激素檢測(cè)進(jìn)行妊娠診斷的方法報(bào)道較多，人妊娠試紙條是檢測(cè)尿液的人絨毛膜促性腺激素( human chorionic gonadotropin,hCG)含量，觀察妊娠情況，但由于物種差異，人的妊娠試紙條很難應(yīng)用到其他動(dòng)物。孕酮是妊娠早期由黃體分泌的甾體激素，主要涉及動(dòng)物妊娠的維持。人妊娠診斷用孕酮和hCG來(lái)預(yù)測(cè)妊娠狀態(tài)。有研究用豬糞便中孕酮含量來(lái)診斷其妊娠狀態(tài)并監(jiān)測(cè)卵巢機(jī)能[6]。馬鹿不同季節(jié)糞便中孕酮也呈周期性變化，同時(shí)也可評(píng)估動(dòng)物健康狀態(tài)，或作為早期妊娠檢測(cè)的手段[7]。類固醇激素檢測(cè)方法相關(guān)報(bào)道較多，如酶聯(lián)免疫吸附劑試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)。ELISA實(shí)用性較廣，已經(jīng)有對(duì)林麝、羊、豬、駱駝和猴等動(dòng)物類固醇激素檢測(cè)的研究報(bào)道[3,8-9]。HPLC也常用于類固醇激素的檢測(cè)，張立雯等[10]用HPLC檢測(cè)大鼠血漿和子宮孕酮濃度，同時(shí)可對(duì)孕酮及其代謝物進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究。也有研究發(fā)現(xiàn)，HPLC可對(duì)孕酮、丙酸睪酮和苯甲酸雌二醇進(jìn)行精確定量[11]，這些結(jié)果對(duì)本研究提供了參考。

林麝是新興的圈養(yǎng)動(dòng)物，很多飼養(yǎng)技術(shù)均來(lái)自長(zhǎng)期的實(shí)踐和借鑒其他家養(yǎng)動(dòng)物的經(jīng)驗(yàn)。林麝早期妊娠診斷是圈養(yǎng)林麝技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。林麝天生孤僻膽小，妊娠早期通過(guò)抓捕等手段進(jìn)行超聲診斷有導(dǎo)致流產(chǎn)的可能。因此，糞便類固醇激素的檢測(cè)是目前首選的診斷方法。目前關(guān)于林麝糞便類固醇激素的研究報(bào)道較多，類固醇激素在體外保存的時(shí)效性，發(fā)情周期孕酮的變化均有研究報(bào)道[12-14]。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，利用ELISA和HPLC兩種方法檢測(cè)林麝糞便孕酮含量進(jìn)行比較；野生動(dòng)物糞便均在野外和山區(qū)進(jìn)行采集，采集時(shí)間的新鮮度難以保證，本研究探索不同新鮮度糞便孕酮的水平變化及確定妊娠和非妊娠林麝糞便孕酮水平，為孕酮用于妊娠診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 圈養(yǎng)林麝，飼養(yǎng)于鳳縣周家莊蔣家溝逢春林麝繁育基地，自由飲食，除飼養(yǎng)員外沒(méi)有其他外界因素干擾。

1.1.2 采樣和糞便處理 確定妊娠中期和非妊娠的林麝各3只，每隔1 d采集糞便1次，共采集3次，每次采集后進(jìn)行激素提取。采集妊娠期的糞便，在空氣暴露不同時(shí)間，分別于暴露0、2、4、6 d。在不同時(shí)間收集糞便，直接提取孕酮。

1.1.3 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒，MP Biomedicals公司產(chǎn)品；PCR mix，近岸蛋白質(zhì)科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；Agilent TC-18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，安捷倫科技公司產(chǎn)品；磷酸，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；鹿孕酮檢測(cè)試劑盒，上海嵐派生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR 稱取0.3 g新鮮糞便，用糞便DNA提取試劑盒分離糞便總DNA，具體方法按照試劑盒的操作指南進(jìn)行。以林麝的內(nèi)參基因GAPDH(forward:3′-TCACCGAGGCTGCTTTTAAT-5′； reverse:3′-GATCTCGCTCCTGAGAGATG-5′)來(lái)檢測(cè)糞便是否來(lái)自于林麝，PCR體系為20 μL，引物0.3 μL，模版0.3 μL，無(wú)菌雙蒸水(ddH2O) 9.4 μL，PCR mix 10 μL，混勻，離心備用，每次做3個(gè)重復(fù)。PCR條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s,59℃ 30 s,72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.2 孕酮提取 稱取0.5 g糞便樣本，按照以前報(bào)道的方法提取激素。稱取0.5 g林麝糞便，每個(gè)樣本稱取2份，1份用于提取激素，另1份在120℃烘干30 min，稱取烘干后糞便質(zhì)量。提取激素的糞便，用提取液(甲醇∶水=9∶1)5 mL與研磨后的糞便充分振蕩混勻，在試管中蒸20 min，1 500 r/min離心10 min，取上清，再次加入5 mL提取液振蕩混勻，1 500 r/min離心10 min收集溶液，蒸干加入1 mL甲醇充分溶解，用1.5 mL EP管收集后立即檢測(cè)或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 孕酮含量測(cè)定

1.2.3.1 HPLC法 HPLC測(cè)定孕酮含量方法參照文獻(xiàn)[10]的色譜條件。使用Agela Venusil C8 (4.6 mm ×250 mm,5 μm)色譜柱,乙腈∶水= 60∶40 (水中加1 g/L磷酸), 流速0.8 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：混合對(duì)照工作液，以甲醇為溶劑配制貯備液,黃體酮濃度為3.2 mg/mL。將貯備液用倍數(shù)稀釋法稀釋成含系列濃度的對(duì)照工作液，濃度分別為3.2 mg/mL、320 μg/mL、3.2 μg/mL、320 ng/mL。

測(cè)定方法：處理好的樣品經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾，吸取預(yù)處理所得樣品上清液10 μL,注入色譜儀,記錄測(cè)定組分峰面積,代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中所含測(cè)定組分的濃度。

1.2.3.2 ELISA法 用ELISA檢測(cè)甲醇中的孕酮含量參照文獻(xiàn)[15]方法。試劑盒用鹿孕酮檢測(cè)試劑盒(DM-D10706)，具體方法按照試劑盒操作指南進(jìn)行，先按照說(shuō)明書(shū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)增加樣品孔，檢測(cè)樣本孕酮濃度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)樣本檢測(cè)的結(jié)果，用糞便干重進(jìn)行矯正，即用ELISA檢測(cè)結(jié)果與糞便干重進(jìn)行計(jì)算干重糞便的孕酮含量,單位為ng/g。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Spass 13.0軟件處理，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢測(cè)，P<0.05為差異顯著。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 糞便空氣暴露顯著降低糞便水分和改變糞便形態(tài)

新鮮糞便表面光澤、平滑，隨著空氣中暴露時(shí)間延長(zhǎng)，糞便表面粗糙程度增加，并失去光澤(圖1)。

由圖2可知，本研究6個(gè)糞便樣本均來(lái)源于林麝。

4 d 和6 d的糞便濕重和干重的比例率顯著低于0 d(P<0.05)，2 d的水分丟失率與0 d無(wú)顯著差異(P>0.05) (圖3)。且以林麝內(nèi)參基因GAPDH為引物進(jìn)行PCR顯示有相應(yīng)條帶(圖2)。結(jié)果表明，林麝顆粒狀糞便在體外空氣暴露可逐漸失水和表觀變化，且可為確定采集林麝糞便的排糞時(shí)間提供參考。

A.0 d;B.2 d;C.4 d;D.6 d

圖1空氣暴露不同時(shí)間的糞便形態(tài)

Fig.1 Morphology of feces in different time of air exposure

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～6.樣品

M.DNA Marker DL 2 000;1-6.Sample

圖2糞便PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 PCR result of feces

2.2 高效液相不能有效檢測(cè)糞便孕酮

如圖4所示，高效液相檢測(cè)孕酮最低分析峰的濃度為32 μg/mL，檢測(cè)糞便樣本時(shí)沒(méi)有峰出現(xiàn)，通過(guò)孕酮酶聯(lián)免疫試劑盒分析發(fā)現(xiàn),樣本的濃度為460 ng/mL,說(shuō)明林麝糞便孕酮濃度顯著低于高效液相的最低檢測(cè)限，因此高效液相不適用于林麝糞便孕酮的檢測(cè)。

圖3 空氣暴露不同時(shí)間的糞便失水率

2.3 空氣暴露對(duì)孕酮水平的影響

空氣暴露不同時(shí)間的糞便提取的孕酮，孕酮含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少，其中空氣暴露4 d和6 d的孕酮含量顯著低于0 d(P<0.05)。空氣暴露2 d與0 d相比，孕酮含量降低，但差異不顯著(P>0.05)(圖5)。糞便空氣暴露，孕酮也直接與空氣接觸，同時(shí)孕酮在糞便內(nèi)大量復(fù)雜的微生物環(huán)境時(shí)間也延長(zhǎng)，這些因素可能導(dǎo)致孕酮逐漸降解。

A.最低檢測(cè)濃度的孕酮色譜峰，箭頭指示孕酮色譜峰；B.高效液相檢測(cè)林麝糞便樣本，無(wú)分析峰出現(xiàn)

A.Chromatographic peak was detected at lowest concentration of progesterone,arrow indicats the chromatographic peak；B.Sample from feces of forest musk deer was detected by HPLC,chromatographic peak no appears

圖4高效液相檢測(cè)孕酮含量

Fig.4 Detection of progesterone level by HPLC

2.4 妊娠期孕酮保持較高水平

連續(xù)采集5 d的糞便樣本提取孕酮，發(fā)現(xiàn)連續(xù)5 d妊娠林麝糞便孕酮含量顯著高于非妊娠林麝，如1 d(P<0.05 )、3 d(P<0.05)和5 d(P<0.05) (圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠中期的孕酮含量均高于150 ng/g，而非妊娠個(gè)體低于150 ng/g。這證明妊娠著床后，胎盤逐漸代替黃體成為孕酮分泌的主要器官，早期所分泌的孕酮顯著高于非妊娠個(gè)體，為后續(xù)孕酮診斷方法的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

圖5 林麝糞便空氣暴露不同時(shí)間與孕激素水平

圖6 妊娠林麝糞便孕酮水平

3 討論

林麝是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是我國(guó)一級(jí)瀕危保護(hù)動(dòng)物，同時(shí)也是我國(guó)新興的圈養(yǎng)動(dòng)物。林麝是秋冬季發(fā)情的動(dòng)物，在發(fā)情季節(jié)交配，如果交配失敗或中途妊娠終止，需要等到下一年的發(fā)情期[16]。因此對(duì)林麝妊娠的鑒定具有重要意義。確定是否交配成功，除了飼養(yǎng)過(guò)程觀察是否發(fā)生性行為，就是人為判定發(fā)生了交配行為。如果這個(gè)發(fā)情季節(jié)沒(méi)有交配成功，則又耽誤了林麝的繁殖機(jī)會(huì)。林麝的人工授精技術(shù)雖然有研究報(bào)道，但林麝數(shù)量少，市場(chǎng)價(jià)值高，這項(xiàng)技術(shù)很難進(jìn)行廣泛應(yīng)用。因此，對(duì)林麝早期妊娠的鑒定，提高繁殖效率尤為重要。孕酮是排卵后顆粒細(xì)胞分化而來(lái)的黃體細(xì)胞分泌的激素，是維持哺乳動(dòng)物妊娠的重要激素，因此，孕酮是鑒定妊娠的候選因子之一[17]。糞便采集尤其是野外場(chǎng)地的采集，不能及時(shí)進(jìn)行冷凍保存。因此，需要檢測(cè)糞便在空氣暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)是否會(huì)影響孕酮含量的檢測(cè)。

有研究將新鮮采集的糞便置于甲醇溶液中，置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ灿醒芯繉⑻崛〉脑型芙庠诩状贾?，?20℃保存不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在1個(gè)月內(nèi)沒(méi)有顯著降解。也有研究將糞便直接在-20℃保存，孕酮可在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間保持不變，但反復(fù)凍融能影響其濃度[18]。孕酮能在低溫下長(zhǎng)期保持與本研究的結(jié)果相反，本研究發(fā)現(xiàn)，在野外條件下，空氣暴露不同時(shí)間，孕酮含量在第4天后顯著下降。關(guān)于這方面的研究報(bào)道較少，這可能是由于孕酮在糞便復(fù)雜微生物及空氣氧化的作用下降解加速[19]。

孕酮用于動(dòng)物妊娠診斷具有廣闊的應(yīng)用前景，根據(jù)孕酮含量和持續(xù)時(shí)間可判斷動(dòng)物的生理狀態(tài)。李詠梅[9]用外周血孕酮含量診斷雙峰駝早期妊娠取得了良好效果，診斷成功率達(dá)100%。有研究用母豬糞便為材料，用酶聯(lián)免疫的方法檢測(cè)孕酮含量預(yù)測(cè)母豬妊娠[20]。有研究認(rèn)為糞便孕酮濃度大于200 ng/g為妊娠，小于這個(gè)濃度為非妊娠[21]，這與我們測(cè)定的數(shù)據(jù)相似(90 ng/g～360 ng/g)。本研究孕酮可作為妊娠檢測(cè)的證據(jù)，但同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)單次檢測(cè)糞便孕酮水平評(píng)價(jià)妊娠狀態(tài)誤差較大，需要連續(xù)多次檢測(cè)。胚胎著床前孕酮主要由黃體分泌，著床后主要由胎盤分泌[22]。正常繁殖周期，孕酮水平也發(fā)生周期性變化，受精后孕酮水平不會(huì)發(fā)生周期性變化，同時(shí)還會(huì)由于胎盤的分泌補(bǔ)充，孕酮水平增高[23-24]。因此，孕酮作為妊娠鑒定候選因子，主要將妊娠持久黃體分泌孕酮與周期性黃體分泌孕酮區(qū)分，這就需要多次檢測(cè)，監(jiān)控孕酮水平，可提高妊娠檢測(cè)的準(zhǔn)確性。除了妊娠檢測(cè)，孕酮水平也可反映繁殖季節(jié)野生種群雌性動(dòng)物的繁殖狀態(tài)，這是評(píng)價(jià)野生動(dòng)物生態(tài)學(xué)健康的指標(biāo)之一[25]。

綜上所述，林麝是新興的圈養(yǎng)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，林麝早期妊娠診斷是人工繁育的重要環(huán)節(jié)，目前雖然有研究報(bào)道，但技術(shù)不成熟，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。孕酮是重要的妊娠檢測(cè)候選因子，有待繼續(xù)探索穩(wěn)定高效孕酮檢測(cè)方法，用于林麝等動(dòng)物的非損傷性妊娠診斷。