楊理凱，郭苗苗，杜偉立，丁 銳，王 令，張 濤，路宏朝

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)基因組由單股、負(fù)鏈、8個(gè)不連續(xù)片段的RNA組成，根據(jù)表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)與神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)的抗原性差異，可進(jìn)一步分為18種HA亞型和11種NA 亞型[1-2]。由于禽流感病毒能自然感染人、畜和禽等多種動(dòng)物，其感染性強(qiáng)，容易突然暴發(fā)，引起大規(guī)模疫情，威脅公共衛(wèi)生安全[3]。疫苗接種是預(yù)防流感病毒感染的有效方法，傳統(tǒng)的病毒疫苗生產(chǎn)以雞胚為載體，再經(jīng)過(guò)滅活或裂解的方式處理病毒，獲得疫苗[4-5]。傳統(tǒng)方式生產(chǎn)的滅活或弱毒禽流感疫苗存在生物安全性差和有效抗原HA蛋白表達(dá)量低等問(wèn)題[6]，建立快速高效的流感病毒毒力因子HA蛋白的表達(dá)鑒定體系是解決后續(xù)疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵。大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、周期短和表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，成為表達(dá)外源基因的首選系統(tǒng)[7]。本試驗(yàn)以禽流感病毒H5N1的主要抗原HA作為研究對(duì)象，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-HA，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，觀(guān)察IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)HA表達(dá)的影響，從而探索最佳IPTG誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間，以獲得大量HA蛋白，為禽流感的診斷和疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌Rosetta菌株，Top10菌株，原核表達(dá)載體pET32a，pPIC3.5K-HA重組質(zhì)粒，陜西理工大學(xué)分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶，限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，氨芐青霉素和異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG),寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Protein Marker，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA純化試劑盒，BioFlux公司產(chǎn)品；鼠抗Flag單克隆抗體，Cell Signaling公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG抗體，康為世紀(jì)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 pET32a-HA載體構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)室保存的pPIC3.5K-HA載體含有禽流感病毒H5N1的HA基因(GenBank:MF116312.1)和Flag標(biāo)簽，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pPIC3.5K-HA載體獲得HA-Flag基因片段，克隆至原核表達(dá)載體pET32a。酶切體系如下：2 μg質(zhì)粒DNA(pPIC3.5K-HA質(zhì)粒/pET32a質(zhì)粒)，4 μL K buffer，各1.5 μLBamHⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶，補(bǔ)純凈水至40 μL。將上述酶切體系置于37℃水浴1 h，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的片段HA-Flag和骨架載體pET32a。通過(guò)T4 DNA連接酶將HA-Flag酶切片段和pET32a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板(100 μg/mL 氨芐青霉素)，篩選重組克隆。選擇單克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定獲得重組載體pET32a-HA。提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pET32a-HA轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌 Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB平板(100 μg/mL氨芐青霉素)，篩選重組菌株Rosetta/pET32a-HA。

1.2.2 pET32a-HA原核表達(dá)條件優(yōu)化 將重組菌株Rosetta/pET32a-HA按照1∶100比例稀釋后分別接種至3 mL LB液體培養(yǎng)基(100 μg/mL氨芐青霉素)，于37℃培養(yǎng)至OD600約0.5，加入不同體積的IPTG(0.1 mol/L)使其終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h。收集菌液，處理總蛋白，SDS-PAGE電泳分析HA蛋白表達(dá)情況，探索IPTG最佳誘導(dǎo)濃度。

將重組菌株Rosetta/pET32a-HA按照1∶100比例稀釋后分別接種至3 mL LB液體培養(yǎng)基(100 μg/mL 氨芐青霉素)，于37℃培養(yǎng)至OD600約0.5，加入6 μL IPTG(0.1 mol/L)，分別誘導(dǎo)3、4、5、6、7、8、9、10、12、24 h，收集菌液，處理總蛋白，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況，探索誘導(dǎo)表達(dá)最佳時(shí)間。

1.2.3 HA蛋白的表達(dá)檢測(cè)及分析 離心收集誘導(dǎo)后細(xì)菌，加PBS重懸，加上樣緩沖液后細(xì)胞懸液置于沸水浴10 min，迅速置于冰上冷卻，然后于4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清于-20℃保存?zhèn)溆?。取蛋白上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)R250染色凝膠，用ImageJ軟件分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 Western blot分析 取蛋白上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉膜4 h，1∶1 000稀釋鼠抗Flag單克隆抗體作為一抗，4℃過(guò)夜孵育，TBST洗滌3次，用1∶2 000稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG單克隆抗體作為二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光，用Syngene化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 HA基因片段的獲得

用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切pPIC3.5K-HA和pET32a，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。其中泳道2約2 000 bp有一特異條帶，與HA基因1 720 bp基本一致。比較泳道3、4可知，酶切后的pET32a被線(xiàn)性化，只有一條明顯的DNA條帶(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.pIC3.5K-HA未切 ；2.雙酶切pIC3.5K-HA；3.pET32a未切；4.雙酶切 pET32a

M.DNA Marker DL 2 000；1.pIC3.5K-HA uncut；2.Double digestion of pIC3.5K-HA；3.pET32a uncut；4.Double digestion of pET32a

圖1EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pPIC3.5K-HA和pET32a載體

Fig.1 pPIC3.5K-HA and pET32a byEcoRⅠ/BamHⅠdouble digestion

2.2 酶切鑒定重組載體pET32a-HA

將圖1酶切獲得的HA片段和pET32a質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆置于LB培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒。然后以BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，泳道2可見(jiàn)酶切后有一個(gè)DNA條帶位于1 500 bp～2 000 bp之間(圖2)，與理論的HA片段大小相一致，說(shuō)明HA基因成功插入pET32a載體，獲得重組載體pET32a-HA。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.質(zhì)粒未切；2.BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒

M.DNA Marker DL 5 000；1.Plasmid uncut；2.BamHⅠ andEcoRⅠ digestion of plasmid

圖2重組載體酶切鑒定

Fig.2 Identification of recombinant vector by enzyme digestion

2.3 重組菌株原核表達(dá)條件優(yōu)化及其檢測(cè)

2.3.1 HA蛋白初步表達(dá)分析 將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素LB平板，然后挑取3個(gè)單克隆，誘導(dǎo)表達(dá)并收集菌液，取蛋白上清液，用SDS-PAGE電泳鑒定，泳道1為Rosetta菌株，泳道2、3為陰性對(duì)照，泳道4、5為1號(hào)克隆，泳道6、7為2號(hào)克隆，泳道8、9為3號(hào)克隆。結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的3個(gè)克隆在70 ku～100 ku之間有一條特異蛋白條帶(箭頭所示)，與理論蛋白84 ku的大小一致，其中HA蛋白65 ku，trxA 19 ku，而無(wú)IPTG誘導(dǎo)和空白對(duì)照組均未出現(xiàn)類(lèi)似蛋白條帶(圖3)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Rosetta空菌；2.Rosetta/pET32a未誘導(dǎo)；3.Rosetta/pET32a誘導(dǎo)；4、6、8. 1、2、3號(hào)克隆未誘導(dǎo)；5、7、9. 1、2、3號(hào)克隆誘導(dǎo)

M.Protein molecular weight Marker；1.Rosetta bacteria；2.Rosetta/pET32a recombinant bacteria without induction；3.Rosetta/pET32a recombinant bacteria indued；4,6,8. 1#,2#,3# clones without induction；5,7,9. 1#,2#,3# clones indued

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白

Fig.3 Detection of the recombinant protein by SDS-PAGE

2.3.2 不同IPTG濃度對(duì)HA蛋白表達(dá)的影響 取2號(hào)克隆的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)9份，采用不同IPTG終濃度誘導(dǎo)HA蛋白表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。通過(guò)軟件進(jìn)行灰度分析，以目標(biāo)蛋白/總蛋白比率評(píng)價(jià)HA蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，總蛋白含量為152 207，目標(biāo)蛋白含量為7 510，HA蛋白占總蛋白表達(dá)量的4.9%，隨著IPTG濃度的提高，目標(biāo)蛋白占總蛋白的比率呈下降趨勢(shì)，故0.1 mmol/L為最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

2.3.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)HA蛋白表達(dá)的影響 取2號(hào)克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)11份，不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)HA蛋白表達(dá)水平的影響，SDS-PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。通過(guò)灰度分析HA蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖8和圖9。誘導(dǎo)9 h的總蛋白量相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值248 462，目標(biāo)蛋白量相對(duì)表達(dá)量為8 943，目標(biāo)蛋白僅占總蛋白的3.6%，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，總蛋白相對(duì)表達(dá)量為130 750，目標(biāo)蛋白量相對(duì)表達(dá)量達(dá)到6 737，目標(biāo)蛋白占總蛋白的5.1%。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，目標(biāo)蛋白占總蛋白的比率呈先上升后下降趨勢(shì)，因此最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

2.3.4 重組菌株中HA基因表達(dá)鑒定 Western blot檢測(cè)重組菌中HA的表達(dá)，以抗Flag的單克隆抗體為一抗，結(jié)果顯示在70 ku～100 ku之間有一條特異蛋白條帶與理論大小(84 ku)相一致，對(duì)照組未出現(xiàn)特異條帶(圖10)，表明重組菌株成功表達(dá)了HA蛋白。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9. 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)

M.Protein molecular weight Marker；1-9. 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 mmol/L IPTG inductions

圖4不同濃度IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白SDS-PAGE結(jié)果

Fig.4 SDS-PAGE results of the target protein induced under different concentrations of IPTG

圖5 不同濃度IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量

圖6 不同濃度IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白與總蛋白比值

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～11. 0、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24 h

M.Protein molecular weight Marker；1-11. 0，3，4，5，6，7，8，9，10，12，24 h

圖7不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)影響的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.7 SDS-PAGE results of the target protein expression under different induction time

圖8 不同誘導(dǎo)時(shí)間的目標(biāo)蛋白表達(dá)量

圖9 不同誘導(dǎo)時(shí)間的目標(biāo)蛋白含量與總蛋白比值

1.Rosetta/pET32a重組菌誘導(dǎo)；2.Rosetta/pET32a-HA重組菌誘導(dǎo)

1.Induced Rosetta/pET32a recombinant bacteria；2.Induced Rosetta/pET32a-HA recombinant bacteria

圖10 Western blot檢測(cè)HA蛋白

Fig.10 Detection of HA protein by Western blot

3 討論

禽流感病毒是以RNA為遺傳物質(zhì)的A型流感病毒,根據(jù)表面糖蛋白血凝素(HA)與神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異，分為多種亞型。HA是禽流感病毒的主要表面抗原之一，其與宿主細(xì)胞唾液酸受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒黏附于細(xì)胞膜，輔助病毒穿膜內(nèi)吞，從而感染細(xì)胞[8-9]。HA還是流感病毒主要毒力因子之一[10]，經(jīng)常產(chǎn)生變異，導(dǎo)致禽流感病毒遺傳性狀改變[11]，以此來(lái)逃逸抗體的識(shí)別。目前，疫苗接種是預(yù)防流感最有效的方式之一，傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)依賴(lài)于雞胚或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生裂解疫苗[12-13]，但這種方法存在生物安全性低等缺陷。大量研究針對(duì)禽流感病毒的重要抗原HA制備疫苗，不僅能預(yù)防流感病毒感染，亦能提高疫苗的生物安全性[14-15]。所以，本研究針對(duì)H5N1的HA抗原，構(gòu)建HA的原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，以實(shí)現(xiàn)抗原蛋白的高效表達(dá)。

異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)是一種高效且易控制的原核表達(dá)誘導(dǎo)劑，適合外源基因的高效誘導(dǎo)表達(dá)[16]。本研究旨在探索誘導(dǎo)HA表達(dá)的最佳IPTG濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間，以提高HA的表達(dá)水平。我們?cè)O(shè)計(jì)了0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mmol/L這9個(gè)IPTG誘導(dǎo)濃度梯度；0、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24 h這11個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間梯度。在探索最佳誘導(dǎo)時(shí)間和最佳誘導(dǎo)濃度過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)影響極其顯著。結(jié)果表明誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L時(shí)，HA蛋白表達(dá)效率最高。

黃瑜等[17]研究發(fā)現(xiàn)，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間或提高IPTG濃度，蛋白表達(dá)量無(wú)明顯增加，說(shuō)明高濃度或長(zhǎng)時(shí)間IPTG誘導(dǎo)對(duì)大腸埃希菌生長(zhǎng)繁殖具有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)6 h后未加IPTG的細(xì)菌培養(yǎng)液OD600高達(dá)5.0，而誘導(dǎo)組OD600最大為3.5，表明在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中IPTG產(chǎn)生了明顯的抑制作用。此外，當(dāng)IPTG濃度大于0.4 mmol/L時(shí)，總蛋白量明顯減少，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過(guò)9 h時(shí)，總蛋白量無(wú)明顯增加。導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因可能是高濃度IPTG和長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，且不利于目標(biāo)蛋白的表達(dá)。有研究表明，H5N1亞型的HA基因含有大腸埃希菌稀有密碼子，甚至有些稀有密碼子使用頻率≤0.28%[18]。本研究中HA蛋白占總蛋白的比例偏低(1.8%～5.9%)，可能受大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性的影響，在后續(xù)的試驗(yàn)中將優(yōu)化HA基因密碼子，以提高HA蛋白表達(dá)量。本試驗(yàn)初步研究了H5N1重要抗原蛋白HA的原核表達(dá)，為后續(xù)HA抗體制備和相關(guān)疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。