譚學(xué)超，郭抗抗，劉發(fā)志，李海敏，姜 洶，蔡雙雙

(1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌 443000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

近年來，在豬瘟(Classical swine fever,CSF)的防控中由于隱性感染和長期帶毒等非典型臨床癥狀的大量出現(xiàn)，給本病的診斷、防控帶來了極大干擾，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。研究豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)致病機(jī)理是探尋新的有效防控方法的基礎(chǔ)。Jiv(J-domain protein interacting with virus,Jiv)是一類與瘟病毒致病性密切相關(guān)的細(xì)胞分子伴侶，屬于熱休克蛋白Dna J家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，Jiv基因在牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的致細(xì)胞病變作用(cytopathic effect,CPE)中必不可少[1]，Jiv基因表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)BVDV的NS2-3聚蛋白的切割而產(chǎn)生NS2和NS3蛋白單體，通過NS3蛋白促使BVDV產(chǎn)生CPE，同時(shí)調(diào)節(jié)病毒在感染細(xì)胞內(nèi)的RNA復(fù)制[2]。CSFV和BVDV同屬于瘟病毒屬成員，在基因組結(jié)構(gòu)、致病機(jī)制上有諸多相似性，所以推測Jiv蛋白在CSFV感染和致病中也可能發(fā)揮著重要作用。Gallei A等[3]將Jiv基因與CSFV Alfort-p447毒株基因組整合構(gòu)建了重組病毒Alfort-Jiv，感染SK-6細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)大量NS3蛋白得出現(xiàn)，并在感染細(xì)胞中出現(xiàn)CPE，重組病毒在核酸水平的復(fù)制較親本病毒Alfort-p447毒株更高。研究表明,Jiv基因插入CSFV基因組中并表達(dá)，在CSFV感染和復(fù)制過程中發(fā)揮作用。但其參與CSFV致病作用和RNA復(fù)制的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)以Jiv為研究對象，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對3種豬源細(xì)胞感染CSFV后Jiv和病毒基因表達(dá)進(jìn)行檢測，分析二者之間的相關(guān)性，探究細(xì)胞Jiv基因在CSFV感染細(xì)胞中表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步明確Jiv蛋白參與CSFV復(fù)制的機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和病毒 豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(SUVEC)、豬腎細(xì)胞(PK-15)、豬睪丸細(xì)胞(ST)，西北農(nóng)林科技大學(xué)重大畜禽疫病防治與畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室提供；CSFV石門株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 主要試劑 SYBR GreenⅠPremix試劑、PCR試劑、DL 2 000 Marker、pMD19-T simple vector、DNA回收試劑盒、一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒，天根生物工程公司產(chǎn)品；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；Trizol裂解液，英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司Invitrigen產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[4]所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法擴(kuò)增Jiv基因和β-actin內(nèi)參基因。擴(kuò)增豬Jiv基因的上游引物(Jiv-F)：5′-GTCAGGCAGATAAGCGTAGA-3′,下游引物(Jiv-R)：5′-CCACTAATACCAGCAGTTCG-3′，產(chǎn)物的長度為109 bp。擴(kuò)增豬β-actin基因的引物序列為：5′-CAAGGACCTCTACGCCAACAC-3′(β-actin-F)，5′-TGGAGGCGCGATGATCTT-3′(β-actin-R)，產(chǎn)物的長度為125 bp。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司Invitrogen合成，使用濃度均為10 μmol/L。

1.2.2 細(xì)胞接毒 用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)ST、PK-15、SUVEC細(xì)胞，待細(xì)胞的匯合度達(dá)到60%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，每孔接種CSFV石門株200 μL(MOI=1)，補(bǔ)加DMEM培養(yǎng)液(含20 mL/L FBS)至1 mL，37℃下孵育2 h后吸出病毒液，換DMEM培養(yǎng)液(含20 mL/L FBS)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。分別于0、24、48、72、96 h后用2.5 mg/mL胰酶消化制成細(xì)胞懸液備用。

1.2.3 細(xì)胞總RNA的提取和cDNA合成 用Trizol法對1.2.2獲得的3種細(xì)胞系在CSFV感染后不同時(shí)間收集的樣品提取RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄以O(shè)ligo隨機(jī)引物進(jìn)行，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 Jiv和CSFV基因的檢測 以獲得的3種細(xì)胞系感染CSFV后不同時(shí)間的cDNA為模板，參照文獻(xiàn)[4]所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR對Jiv和β-actin內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增，參照文獻(xiàn)[5]建立的豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR對CSFV的5′-UTR基因進(jìn)行擴(kuò)增，最終結(jié)果均引入內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行校正，以2-△△Ct值表示。

2 結(jié)果

2.1 SUVEC細(xì)胞Jiv和CSFV基因檢測結(jié)果

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SUVEC細(xì)胞在CSFV感染后不同時(shí)間的Jiv和CSFV基因表達(dá)，結(jié)果顯示，在0～72 h，二者均隨感染時(shí)間逐步上升， 96 h時(shí)有所下降，變化趨勢基本一致(圖1)；在0～48 h，Jiv基因mRNA表達(dá)上升幅度顯著高于其他時(shí)間段。

2.2 PK-15細(xì)胞Jiv和CSFV基因檢測結(jié)果

對PK-15細(xì)胞Jiv和CSFV基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，PK-15細(xì)胞中Jiv和CSFV基因表達(dá)在各感染時(shí)間也呈正相關(guān)現(xiàn)象，變化趨勢與SUVEC細(xì)胞基本一致(圖2)。

A.Jiv的mRNA;B.CSFV的RNA

A.Jiv mRNA;B.CSFV RNA

圖1 SUVEC細(xì)胞Jiv和CSFV基因檢測結(jié)果

Fig.1 The results of Jiv and CSFV genes expression in SUVEC cells

2.3 ST細(xì)胞Jiv和CSFV基因檢測結(jié)果

對ST細(xì)胞Jiv和CSFV基因在各感染時(shí)間段進(jìn)行檢測，顯示二者的變化趨勢與上述兩種細(xì)胞基本一致，ST細(xì)胞在各感染時(shí)間的Jiv和CSFV的基因表達(dá)水平均高于其他兩種細(xì)胞(圖3)。

從上述結(jié)果可以看出，SUVEC、PK-15和ST細(xì)胞中均存在的Jiv基因的表達(dá)，其中ST細(xì)胞的表達(dá)水平最高，分別為SUVEC和PK-15細(xì)胞的3.8倍和2.1倍，表明細(xì)胞本身表達(dá)Jiv蛋白，不同細(xì)胞類型間存在表達(dá)差異。比較3種細(xì)胞中CSFV基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ST細(xì)胞也顯著高于其他兩種細(xì)胞，說明細(xì)胞Jiv蛋白表達(dá)可能影響CSFV的RNA復(fù)制，提示Jiv蛋白在CSFV復(fù)制中可能發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞感染CSFV后，在各感染時(shí)間Jiv基因在mRNA水平較未感染細(xì)胞均有顯著增高，其中0～48 h的增幅均高于其他時(shí)間，表明CSFV感染能促進(jìn)細(xì)胞Jiv基因的表達(dá)，在感染早期這種作用較為明顯。此外，Jiv基因在核酸水平的表達(dá)變化和CSFV基本一致，呈正相關(guān)限項(xiàng)，表明Jiv基因表達(dá)與CSFV核酸復(fù)制存在聯(lián)系。

A.Jiv的mRNA;B.CSFV的RNA

A.Jiv mRNA;B.CSFV RNA

圖2 PK-15細(xì)胞Jiv和CSFV基因檢測結(jié)果

Fig.2 The results of Jiv and CSFV genes expression in PK-15 cells

A.Jiv的mRNA;B.CSFV的RNA

A.Jiv mRNA;B.CSFV RNA

圖3 ST細(xì)胞Jiv和CSFV基因檢測結(jié)果

Fig.3 The results of Jiv and CSFV genes expression in ST cells

3 討論

豬瘟病毒免疫耐受和免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，CSFV持續(xù)性感染機(jī)制的闡明是研究有針對性措施的基礎(chǔ)。CSFV在宿主體內(nèi)的感染和致病過程需要宿主調(diào)節(jié)因子和病毒蛋白的相互作用才能完成，宿主蛋白在CSFV致病中也發(fā)揮著重要的作用[6]。目前，CSFV自身蛋白的作用研究已較深入，而宿主蛋白參與CSFV的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清晰，Jiv蛋白與CSFV相互作用關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，可能為進(jìn)一步闡明CSFV致病機(jī)理提供新的突破口。研究表明，Jiv蛋白的表達(dá)對CSFV的感染性和致病性都有明顯的作用[3]，但Jiv蛋白與CSFV作用機(jī)制還有待研究。因此，檢測分析宿主細(xì)胞內(nèi)Jiv基因在感染CSFV不同時(shí)間的表達(dá)規(guī)律，對Jiv與CSFV在感染過程中的基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，可對進(jìn)一步明確Jiv參與CSFV致病機(jī)制研究提供參考資料。

本研究所用的Jiv基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR是筆者通過試驗(yàn)優(yōu)化后的方法，對其特異性、敏感性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性均進(jìn)行了試驗(yàn)論證，因此，最終獲得的結(jié)果具有較高的可信度。

在對豬瘟病毒感染的3種豬源細(xì)胞(ST、PK、SUVEC)在感染不同時(shí)間的Jiv和CSFV基因表達(dá)進(jìn)行檢測的過程中，分別對3種細(xì)胞在CSFV不同感染時(shí)間采集樣品作為平行試驗(yàn)組，參照不同細(xì)胞的檢測結(jié)果使得數(shù)據(jù)更加可靠。結(jié)果顯示，在CSFV不同感染時(shí)間，Jiv和CSFV的基因表達(dá)在各豬源細(xì)胞株中均呈現(xiàn)出類似的現(xiàn)象，呈正相關(guān)趨勢，說明細(xì)胞Jiv基因表達(dá)與CSFV核酸復(fù)制存在密切聯(lián)系，而二者之間是否存在相互作用，目前尚不能得出結(jié)論，還需進(jìn)一步研究。Jiv的mRNA在0～48 h的增幅高于其他時(shí)間段，推測Jiv蛋白參與CSFV核酸復(fù)制可能主要發(fā)生在病毒感染早期。此外，ST細(xì)胞中Jiv基因mRNA表達(dá)和CSFV核酸復(fù)制在各感染時(shí)間均高于其他兩種細(xì)胞，提示Jiv基因在不同細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異可能影響CSFV的復(fù)制，這一發(fā)現(xiàn)與Guo K K等[7]研究Jiv基因在不同豬源組織的表達(dá)差異與CSFV組織嗜性的關(guān)系所獲得結(jié)果具有極高的相似性，據(jù)此推測CSFV在感染機(jī)體時(shí)選擇增殖靶組織的原因可能與Jiv在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異有關(guān)。

基于上述結(jié)果，推測細(xì)胞Jiv基因的表達(dá)可能與CSFV復(fù)制有著密切的關(guān)系，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究和闡明。