于正青，宋軍科，張會(huì)軍，劉婷麗，范現(xiàn)成，趙光輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

泰勒蟲屬于泰勒科(Theileriidae)泰勒屬(Theileria)的蜱傳性血液原蟲，寄生于牛羊和其他野生動(dòng)物巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)，可引起動(dòng)物高熱、消瘦、貧血及體表淋巴結(jié)腫大，降低動(dòng)物的飼料報(bào)酬，在很大程度上阻礙了養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[1]。自1914年首次在埃及報(bào)道泰勒蟲以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)可感染羊的泰勒蟲有11個(gè)種，分別是呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)、萊氏泰勒蟲(T.lestoquardi)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)、尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、分離泰勒蟲(T.separata)、隱藏泰勒蟲(T.recondita)、馬泰勒蟲(T.equi)、 環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)、Theileirasp. B15a、Theileriasp. OT3及Theileriasp. MK[2-6]，其中T.uilenbergi、T.luwenshuni及T.lestoquardi致病力最強(qiáng)[6-7]，而T.ovis、T.recondita、T.separata、Theileriasp. OT3及Theileriasp. MK致病性很弱或無(wú)致病性[1,7-11]。在中國(guó)已報(bào)道的羊泰勒蟲有T.luwenshuni、T.ovis及T.uilenbergi[12]，以T.luwenshuni和T.ilenbergi的混合感染較為常見[7]。對(duì)羊泰勒蟲病傳統(tǒng)的診斷方法是顯微鏡鏡檢，結(jié)合流行病學(xué)特點(diǎn)并尋找宿主蜱來(lái)確診，但該方法準(zhǔn)確性差、檢出率低，且需要非常專業(yè)的人員[12]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，real-time qPCR)及反向線狀印跡(reverse line blot，RLB)等方法有著靈敏、高效及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用于羊泰勒蟲的檢測(cè)[3,13-15]。

近年來(lái)，隨著養(yǎng)羊業(yè)的迅速發(fā)展，羊泰勒蟲病的發(fā)病趨勢(shì)也在逐步上升，而該病在自然感染病例中常為隱性感染，加劇了該病的防控難度[13]。陜西省作為我國(guó)重要的養(yǎng)羊大省，擁有眾多的地方品種。其中分布于漢中、安康等陜南地區(qū)的陜南白山羊因皮質(zhì)好，同時(shí)具有良好的產(chǎn)肉性能，是典型的肉皮兩用品種。由于陜南地區(qū)多處于秦嶺山脈，林草資源豐富，但也成為蜱生長(zhǎng)繁殖的理想場(chǎng)所，因此，該地區(qū)動(dòng)物也受到蜱傳病的危害。為了解陜南白山羊泰勒蟲的感染現(xiàn)狀和特點(diǎn)，本研究基于核糖體小亞基RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因位點(diǎn)的分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)該地區(qū)陜南白山羊泰勒蟲的感染情況進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)泰勒蟲SSU rRNA基因進(jìn)行測(cè)序分析，研究結(jié)果將為該地區(qū)羊泰勒蟲病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 來(lái)自陜西省鎮(zhèn)巴縣3個(gè)羊場(chǎng)的山羊血液，其中3月齡～6月齡14份，7月齡～12月齡35份，大于12月齡72份。

1.1.2 主要試劑 姬姆薩染色液，北京索寶生物科技有限公司產(chǎn)品；血液基因組DNA提取試劑盒SK8254，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；ExTaqDNA聚合酶、6 × Loading buffer、DNA Marker DL 5 000、溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)，寶生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，上海英濰捷基貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 SW-CJ型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；C-XP-D型PCR擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；HC3018型臺(tái)式高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-12型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；ChampGel 5000型紫外凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；AUY220型精密電子天平，上海光學(xué)儀器一廠產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，上海人和科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；微量移液器，北京大龍興創(chuàng)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血液樣品采集 2017年7月從陜西省鎮(zhèn)巴縣3個(gè)羊場(chǎng)(分別以XX、SX和SH命名)共采集到山羊血液樣品121份。使用一次性滅菌器材經(jīng)頸靜脈采血，采集的血液樣品立即置于含有2 mL 15 mg/mL K3-EDTA的抗凝管中并保存在冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱保存待檢。

1.2.2 血液涂片制作 取約3 μL血液樣品,均勻涂于載玻片上待自然風(fēng)干后，放入無(wú)水甲醇中固定2 h，取出后在室溫下自然晾干；將晾干的載玻片用姬姆薩染液染色30 min后取出自然風(fēng)干，然后再用蒸餾水沖洗以去除染色顆粒，待染色血液涂片自然風(fēng)干后置于100倍油鏡下觀察。

1.2.3 基因組DNA的提取 從血液樣品中取出100 μL血樣移入1.5 mL離心管中，按照血液基因組DNA提取試劑盒SK8254說(shuō)明書進(jìn)行操作,提取血液基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 套式PCR擴(kuò)增 根據(jù)Ge Y等[15]已發(fā)表的擴(kuò)增泰勒蟲SSU rRNA基因的引物(表1)進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。本研究中所用引物均由擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司(西安)合成。PCR擴(kuò)增體系為：ExTaq酶0.2 U，2.5 μL 10 × PCR buffer，1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，2.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s， 30 s(退火溫度見表1)，72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5 μg/mL溴化乙錠的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

表1 引物序列

1.2.5 序列分析及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建 電泳結(jié)果PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用的測(cè)序儀為ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。測(cè)序成功的序列用Clustal X 1.83進(jìn)行比對(duì)并參考圖譜校正序列，將校正后的序列運(yùn)用BLAST進(jìn)行同源性搜索，與GenBank中已有的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。獲取自GenBank中的T.luwenshuni(JN676988、AF081136)、T.ovis(FJ603460、EU622911)、T.separata(AY260175)、Theileriasp. OT3(DQ866839、AY533145)和T.uilenbergi(KJ188232、JF719835)SSU rRNA基因序列，以Babesiaovis(AY150058)SSU rRNA基因序列作為外群，利用MEGA 7.0軟件，用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)和Kimura 2-parameter模型構(gòu)建SSU rRNA基因遺傳進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 19.0軟件對(duì)陜南白山羊不同年齡段感染率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異顯著；當(dāng)P>0.05時(shí)，差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 山羊血液涂片染色鏡檢觀察

通過(guò)對(duì)制備的血液涂片進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)112份血液樣品中的紅細(xì)胞內(nèi)存在大小約1 μm，呈圓點(diǎn)形、卵圓形或短桿狀多形性蟲體(圖1)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)121份DNA樣品的SSU rRNA基因進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，其中112份樣品(92.6%)成功擴(kuò)增，凝膠電泳顯示，陽(yáng)性樣品在1 400 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖2)。

2.3 山羊泰勒蟲感染情況

本研究中的鏡檢結(jié)果與套式PCR結(jié)果完全一致。所檢測(cè)的121份羊血液樣品中，泰勒蟲總感染率為92.6%(112/121)。其中3月齡～6月齡感染率為92.9%(13/14)，7月齡～12月齡感染率為94.3%(33/35)，大于12月齡感染率為91.7%(66/72)。不同年齡段之間差異不顯著(月齡P>0.05)。3個(gè)羊場(chǎng)中，SH羊場(chǎng)感染率為95.0%(38/40)，XX羊場(chǎng)次之，為92.9%(39/42)，SX羊場(chǎng)感染率為89.7%(35/39)。

A.陽(yáng)性樣品；B.陰性樣品；a.圓點(diǎn)形蟲體；b.卵圓形蟲體；c.短桿狀蟲體

A.Positive sample;B.Negative sample;a.Round shape;b.Ovoid shape;c.Rod shape

圖1血液涂片鏡檢結(jié)果(姬姆薩，1 000×)

Fig.1 The microscopic examination results of blood smear (Giemsa，1 000×)

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～8.樣品PCR產(chǎn)物；9.陽(yáng)性對(duì)照；10.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000;1-8.PCR products of samples;9.Positive control;10.Negative control

圖2泰勒蟲特異性引物的套式PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 The nested PCR results usingTheileriaspecific primers

2.4 序列及遺傳分析

將所有泰勒蟲陽(yáng)性樣品序列通過(guò)Clustal X 1.83進(jìn)行比對(duì)，去除兩端不準(zhǔn)確序列后獲得的序列長(zhǎng)度為1 275 bp，以XX18為代表的106個(gè)分離株基因序列與GenBank中T.luwenshuni的SSU rRNA基因(JN676988)序列同源性為99%，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在59 bp及1 240 bp處分別發(fā)生了堿基顛換(T-G)、堿基轉(zhuǎn)換(T-C)；以SH19為代表的6個(gè)分離株基因序列與該基因(JN676988)序列同源性為99%，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在59、458、487、1 240 bp處分別發(fā)了堿基顛換(T-G)、堿基轉(zhuǎn)換(G-A)、堿基轉(zhuǎn)換(T-C)及堿基轉(zhuǎn)換(T-C)(圖3)。基于泰勒蟲的SSU rRNA基因擴(kuò)增的基因片段并利用NJ法構(gòu)建了遺傳進(jìn)化樹(圖4)，發(fā)現(xiàn)所有陽(yáng)性樣品與T.luwenshuni參考序列歸于一支。

3 討論

羊泰勒蟲病主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，在歐洲、中東、北非、南非及亞洲等地均有報(bào)道。自1958年楊輔國(guó)等[16]首次在我國(guó)四川境內(nèi)報(bào)道泰勒蟲病以來(lái)，我國(guó)共有19個(gè)省(市)報(bào)道了該病[13-14,17-18]。陜南白山羊主要分布于陜西南部地區(qū)，屬北亞熱帶濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫在11 ℃以上，這樣的氣候和環(huán)境非常適合蜱類的生存和繁殖。羊只經(jīng)蜱蟲叮咬后便可引起羊泰勒蟲病的流行。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR診斷以其高靈敏性和特異性逐漸被廣泛應(yīng)用[6,12]。本研究基于SSU rRNA將傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測(cè)與分子生物學(xué)相結(jié)合，對(duì)陜南白山羊中羊泰勒蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查研究。

本研究首先利用形態(tài)學(xué)方法對(duì)采集到的羊血液樣品制作血液涂片后進(jìn)行姬姆薩染色，通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞內(nèi)存在圓點(diǎn)形、卵圓形或短桿狀多形性蟲體，蟲體細(xì)胞核呈深染的紫紅色，原生質(zhì)呈淡染藍(lán)色。這與之前李有全等[19]動(dòng)物感染試驗(yàn)獲得的結(jié)果一致。形態(tài)學(xué)檢測(cè)要求操作人員不僅要熟悉泰勒蟲的各種形態(tài)，還需區(qū)分其他血液原蟲(如巴貝斯蟲)的形態(tài)。由于SSU rRNA基因非常保守，其基因序列的差異大小代表了物種差異大小，因此，分析羊泰勒蟲SSU rRNA基因并測(cè)序就可確定該物種分類地位，繪制其遺傳進(jìn)化樹。通過(guò)遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，本研究所檢測(cè)到的羊泰勒蟲分布于T.luwenshuni所在的進(jìn)化樹分支上，且與參考序列的同源性均達(dá)到了99%以上。從構(gòu)建的進(jìn)化樹可發(fā)現(xiàn)，本研究中的分離株與T.luwenshuni(GenBank登錄號(hào)：JN676988、AF081136)位于同一分支，提示該研究中獲得的泰勒蟲種為T.luwenshuni。Li Y等[14]報(bào)道了湖北和河南羊泰勒蟲的感染情況，其構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹表明，上述地區(qū)羊泰勒蟲均為T.luwenshuni，這表明該泰勒蟲種是這些地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蟲種。

圖3 泰勒蟲分離株SSU rRNA基因序列比對(duì)分析

圖4 基于泰勒蟲SSU rRNA基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

進(jìn)一步通過(guò)套式PCR對(duì)本研究中提取的血液DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，121份樣品中有112份結(jié)果呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)92.6%(112/121)，高于江蘇(67.4%，116/172)[13]、新疆(4.1%，4/98)[13]、貴州(84.0%，42/50)[20]、甘肅(67.0%，351/524)[21]等地。可能是由于本研究中采樣點(diǎn)多位于山地，且以半散養(yǎng)式養(yǎng)殖，加之飼養(yǎng)管理、消毒措施不夠完善，是造成該地區(qū)羊泰勒蟲感染率高的重要原因之一。此外，對(duì)本研究中不同年齡段羊泰蟲感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，12月齡內(nèi)的羊只感染率為93.9%(46/49)，與大于12月齡的羊只(91.7%，66/72)差異不顯著(P>0.05)。Ozubek S等[6]報(bào)道了土耳其山羊和綿羊的感染情況，發(fā)現(xiàn)大于12月齡羊只(49.6%)感染率顯著高于小于12月齡羊只(28.5%)，這可能是由于不同的氣候、品種、檢測(cè)方法等因素造成的。

本研究結(jié)果表明，羊泰勒蟲在陜南白山羊中感染率很高，且以T.luwenshuni感染為主。其結(jié)果不僅為該地區(qū)制定羊泰勒蟲的綜合防控措施提供參考和理論依據(jù)，也豐富了我國(guó)羊泰勒蟲病流行病學(xué)資料。