曲婧格，王也，李熙萌，聶英坤

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150086)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種可能致命并伴有多系統(tǒng)損害的自身免疫疾病，以產(chǎn)生大量自身抗體為特征，并通過(guò)抗原抗體免疫復(fù)合物沉積導(dǎo)致組織損傷，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。干擾素(IFN)是一種可以干擾病毒復(fù)制或傳播的生物性蛋白質(zhì)，包括Ⅰ型(IFN-α、 IFN-β等)、Ⅱ型(IFN-γ)及Ⅲ型(IFN-λ)三種類型[1]。近年研究表明，Ⅰ型IFN在SLE發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，IFN誘導(dǎo)基因如淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合體(LY6E)、IFN誘導(dǎo)蛋白1(IFIT1)在SLE患者PBMCs中顯著升高，并與其疾病活動(dòng)度有一定的相關(guān)性[2,3]。但在同樣能被IFN誘導(dǎo)上調(diào)的系列基因中，S-腺苷甲硫氨酸基區(qū)域蛋白2(RSAD2)在SLE患者中的表達(dá)情況卻鮮有報(bào)道。2017年10月～2018年2月，我們對(duì)SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)內(nèi)RSAD2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討其與SLE患者疾病活動(dòng)度和免疫指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院就診的SLE患者46例作為SLE組，其中男3例、女43例，年齡11～69(45.56±15.35)歲。SLEDAI積分[5](5.9±3.9)分，其中高疾病活動(dòng)度(SLEDAI積分≥6分)25例、低疾病活動(dòng)度(SLEDAI積分<6分)21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)制定的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；外周血血清抗核抗體(ANA)、抗小核糖核蛋白(nRNP)抗體、抗Sm抗體、抗核小體抗體及抗Ro-52抗體、抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)淋巴增生性或除SLE外的自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征和克羅恩病)、慢性感染疾病(如艾滋病)、活動(dòng)性感染、經(jīng)免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素治療。另選同期在我院進(jìn)行健康體檢的性別、年齡匹配的健康對(duì)照者33例作為對(duì)照組，其中男2例、女31例，年齡14～68(43.23±14.47)歲。收集SLE組外周血ANA、nRNP抗體、抗Sm抗體、抗核小體抗體及抗Ro-52抗體、dsDNA抗體、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4資料。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得受試對(duì)象的知情同意。

1.2 主要試劑 人外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；InvitrogenTMTRIzolTMReagent (Thermo Fisher Scientific)； Bulge-LoopTMmRNA qRT-PCR、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green、dNTP、DDT、RNase抑制劑、Oligo(dT)18、異丙醇、氯仿等(銳博生物科技有限試劑)。

1.3 PBMCs內(nèi)RSAD2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。抽取兩組晨起空腹靜脈血2 mL，加入EDTA抗凝管中，采用密度梯度離心法分離PBMCs，加入1 mL TRIzol，吹打至白色沉淀溶解后轉(zhuǎn)入無(wú)酶EP管中，-80 ℃保存。取出已加入TRIzol的標(biāo)本，室溫解凍，依次加入氯仿、異丙醇、冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇、無(wú)RNA酶DEPC水，充分溶解后于60 ℃中孵育5 min。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA，并分別用無(wú)RNA酶的水稀釋10倍。檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，查到人類RSAD2基因的cDNA全長(zhǎng)序列，以DNA STAR軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增模板的引物，以β-actin作為內(nèi)參照基因。RSAD2上游引物5′-TTGGACATTCTCGCTATCTCCT-3′，下游引物5′-AGTGCTTTGATCTGTTCCGTC-3′；β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。各引物均由博尚生物技術(shù)公司合成。配置總體積為20 μL反應(yīng)體系，PCR循環(huán)條件95 ℃ 20 s，95 ℃ 1 s、60 ℃ 20 s共40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。對(duì)RT產(chǎn)物的細(xì)胞拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以2-ΔΔCt為相對(duì)表達(dá)量。按照2-ΔΔCt值將SLE患者分為高RSAD2表達(dá)、低RSAD2表達(dá)兩個(gè)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組RSAD2 mRNA表達(dá)水平比較 SLE組、對(duì)照組RSAD2 mRNA表達(dá)水平分別為8.4±10.7、1.7±1.4，SLE組RSAD2 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.01)。SLE組中高疾病活動(dòng)度者、低疾病活動(dòng)度者RSAD2 mRNA表達(dá)水平分別為11.4± 12.7、4.9 ±6.4，高疾病活動(dòng)度者RSAD2 mRNA表達(dá)水平高于低疾病活動(dòng)度者(P<0.01)。

2.2 不同RSAD2 mRNA表達(dá)程度的SLE患者免疫指標(biāo)比較 46例SLE患者中，RSAD2高表達(dá)23例、低表達(dá)23例。RSAD2高表達(dá)者ANA、抗nRNP抗體陽(yáng)性率均高于RSAD2低表達(dá)者(P均<0.05)。見表1。

2.3 SLE患者RSAD2表達(dá)水平與SLE特異性抗體水平的相關(guān)性 SLE患者RSAD2 mRNA表達(dá)水平與ANA(r=0.39，P<0.01)、抗nRNP抗體(r=0.31，P<0.05)均呈正相關(guān)，而抗Sm抗體、抗dsDNA抗體、抗核小體抗體、抗Ro-52抗體及補(bǔ)體C3、C4均無(wú)明顯相關(guān)(P均>0.05)。

表1 不同RSAD2 mRNA表達(dá)程度的SLE患者免疫指標(biāo)比較(例)

3 討論

SLE是由環(huán)境致病因素、遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素等引起的一種常伴有靶器官損害的自身免疫性疾病，患病率和病死率呈持續(xù)增長(zhǎng)，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。高疾病活動(dòng)度是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的主要因素，其高疾病活動(dòng)度嚴(yán)重影響患者的日常生活。早期或者臨床前期發(fā)現(xiàn)及診斷可以顯著改善或者治愈這種疾病，然而SLE的早期診斷仍是臨床難題。近年研究發(fā)現(xiàn)，在SLE患者中Ⅰ型IFN的血清水平與病情活動(dòng)呈正相關(guān)，IFN誘導(dǎo)基因與SLE發(fā)病密切相關(guān)，高IFN基因表達(dá)的SLE患者年齡較低，有著更高的抗dsDNA抗體或者低補(bǔ)體，病程較短且往往有著更高的活動(dòng)性[6]。特別是Ⅰ型IFN系統(tǒng)，可通過(guò)對(duì)一系列下游基因的調(diào)控誘導(dǎo)自身免疫，因此研究Ⅰ型IFN誘導(dǎo)表達(dá)基因與SLE的關(guān)系具有重要意義。

RSAD2是Ⅰ型IFN介導(dǎo)的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的病毒抑制基因，又被稱作蝰蛇毒素(Viperin)或cig5，位于人類染色體2p25.2上，是一種有著廣泛抗病毒活性的宿主蛋白質(zhì)，近年研究表明，RSAD2與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展[7]。薈萃分析發(fā)現(xiàn)，RSAD2對(duì)SLE有重要的調(diào)控作用，在SLE中較正常對(duì)照表達(dá)明顯升高[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者RSAD2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在CD3+、CD4+、CD19+B細(xì)胞及CD33+髓樣細(xì)胞中較正常對(duì)照細(xì)胞表達(dá)明顯升高[9]。同時(shí)，有基因芯片相關(guān)研究在篩選SLE患者與正常對(duì)照的差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)，RSAD2為顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因。進(jìn)一步在小鼠B淋巴細(xì)胞中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示在SLE鼠B淋巴細(xì)胞中RSAD2較正常小鼠B淋巴細(xì)胞仍然顯著上調(diào)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE組RSAD2 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，SLE組高疾病活動(dòng)度者RSAD2 mRNA表達(dá)水平高于低疾病活動(dòng)度者，提示RSAD2表達(dá)升高可能與SLE的發(fā)生發(fā)展機(jī)制相關(guān)，并可以在一定程度上反映疾病的活動(dòng)情況。

SLE的免疫異常涉及復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用的過(guò)程，B淋巴細(xì)胞是SLE發(fā)病的直接參與者?？乖岢始?xì)胞(APC)通過(guò)膜相關(guān)抗原受體(sIg、BCR)特異性捕獲并提呈抗原，誘導(dǎo)B細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量自身抗體，與自身抗原形成免疫復(fù)合物，通過(guò)Toll樣受體配體，使B淋巴細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)。多種因素均可影響B(tài)淋巴細(xì)胞的免疫活性，如免疫調(diào)節(jié)機(jī)制缺陷、免疫耐受性喪失、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常等[11]。目前已經(jīng)證實(shí)，SLE患者中存在B淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路的持續(xù)激活，基因分析顯示B淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路存在基因表達(dá)缺陷和免疫效應(yīng)分子異常[12,13]。B淋巴細(xì)胞除了分泌自身抗體外，還可以表達(dá)自身抗原，激活T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α和IL-6等[14]。以上多種機(jī)制共同影響了SLE的發(fā)生發(fā)展，而IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的RSAD2，作為一個(gè)抗病毒基因，有研究表明其在銀屑病皮膚中過(guò)表達(dá)，其與IFNα誘導(dǎo)的抗病毒基因表達(dá)中的作用一致[15]，推測(cè)RSAD2的過(guò)表達(dá)與IFN誘導(dǎo)的其他基因共同在SLE發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。SLE經(jīng)典的篩選手段是通過(guò)檢測(cè)血清ANA水平。本研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者中RSAD2高表達(dá)者ANA、抗nRNP抗體陽(yáng)性率均高于RSAD2低表達(dá)者，且SLE患者RSAD2 mRNA表達(dá)水平與ANA、抗nRNP抗體均呈正相關(guān)，提示RSAD2的過(guò)表達(dá)可協(xié)助SLE患者體內(nèi)產(chǎn)生自身抗體，進(jìn)一步表明其可能通過(guò)影響了B淋巴細(xì)胞的免疫活性，從而影響SLE的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，SLE患者RSAD2的表達(dá)水平顯著增高，并與疾病活動(dòng)度及免疫功能相關(guān)，表明RSAD2具有作為SLE生物標(biāo)志物的潛力，抑制RSAD2基因的表達(dá)也可能成為治療SLE的一種新方向。