李林峰，曾 達，林 偉，李雪榕，柳丹鳳，田 甜，劉 敏Δ

1.四川大學(xué) 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院(成都 610041)；2.廣東南天司法鑒定所(深圳 518045)

在法醫(yī)學(xué)實踐中，骨骼肌損傷是機械性暴力最易造成的病理改變之一，其損傷時間常直接關(guān)系到案件的偵查方向及性質(zhì)。目前在法醫(yī)學(xué)實際檢案過程中，要相對準(zhǔn)確地推斷骨骼肌損傷時間較困難，骨骼肌損傷時間的推斷一直是法醫(yī)學(xué)的研究熱點。董塔娜等[1]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)zd2 mRNA表達量在骨骼肌損傷后會隨著損傷時間的延長呈現(xiàn)一定的時序性變化規(guī)律。程子惠等[2]研究表明，骨骼肌損傷后p-CB1R的表達也存在一定的時序性。之前的研究多為對單一生化指標(biāo)進行測定[1-3]，盡管各種生化指標(biāo)的變化存在一定的時序性，但同一個測定值往往對應(yīng)多個時間點，故難以推斷骨骼肌損傷的時間范圍。

金偉等[4]研究表明，腦震蕩傷后通過測定傷后不同時間內(nèi)組織細胞中熱休克蛋白70和c-Fos表達情況，觀察不同損傷時間二者表達比值的變化，并與二者變化情況相結(jié)合，能夠用于推斷腦震蕩的損傷時間。而根據(jù)兩種不同生化指標(biāo)表達比值的改變來推斷骨骼肌損傷時間尚未見研究報道。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一種具備多種效能的細胞生長因子[5]，可促進新的血管形成和創(chuàng)傷組織內(nèi)的細胞增殖進而加速創(chuàng)傷的愈合[6-7]。當(dāng)骨骼肌受到外界暴力打擊時，c-Fos基因作為一種重要的即刻早期基因，迅速被誘導(dǎo)激活并表達，而其表達的蛋白能夠保護損傷的肌肉細胞，減輕損傷對肌細胞的影響[8]。本實驗通過研究大鼠挫傷肌細胞中bFGF與c-Fos的表達情況，分析二者變化情況同骨骼肌損傷時間的關(guān)系，并結(jié)合二者比值變化情況，以期推斷骨骼肌損傷時間。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制作

健康成年SD大鼠65只，雌雄不限，體重180～200 g，購于四川大學(xué)實驗動物中心。依據(jù)處死時間的不同，隨機分為12個實驗組和1個對照組，每組5只。參照Marmarou等[9]實驗方法制作實驗組大鼠骨骼肌挫傷模型：將大鼠俯臥位固定于鼠板上，用海綿墊將備皮后的左后肢稍外旋墊起，使小腿后肌群置于脛腓骨內(nèi)側(cè)，用500 g砝碼從70 cm高度自由下落導(dǎo)致左小腿骨骼肌挫傷，而打擊處皮膚仍保持完整，脛腓骨無骨折。實驗組大鼠于骨骼肌挫傷后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、10 d和14 d采用頸椎脫臼法處死。對照組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)24 h后采用頸椎脫臼法處死。分別取實驗組大鼠挫傷處骨骼肌及對照組大鼠正常骨骼肌，并立即將所取肌肉樣品置于固定液中固定，之后行石蠟包埋、切片。

1.2 染色方法

常規(guī)進行HE染色。免疫組化染色(SABC方法)如下：采用微波加熱對抗原進行修復(fù)后，滴入BSA封閉液封閉非特異性抗原，裝入保濕盒內(nèi)在37 ℃下放置0.5 h后,在實驗組切片上滴加兔抗大鼠c-Fos及bFGF多克隆抗體作為一抗, 陰性對照組切片滴加PBS來替代一抗，滴加一抗后將切片放入4 ℃冰箱過夜。從4 ℃冰箱取出的切片經(jīng)37 ℃復(fù)溫及PBS沖洗后，滴加生物素化的山羊抗兔IgG抗體作為二抗，37 ℃孵育45 min后滴加鏈霉素親和素生物素復(fù)合物，再次置于37 ℃下0.5 h；切片取出后依次加入顯色液及復(fù)染液，待良好顯色后常規(guī)進行脫水、透明、封片。

1.3 染色結(jié)果分析

bFGF及c-Fos陽性表達判定標(biāo)準(zhǔn)為細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻分布的棕黃色細小顆粒，而陰性對照組細胞胞漿內(nèi)無棕黃色細小顆粒。實驗組及對照組切片均在顯微鏡高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野拍照儲存，對收集到的切片圖像進行分析，計算陽性細胞率(陽性細胞率=陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌挫傷后病理學(xué)變化規(guī)律

實驗組大鼠經(jīng)打擊后，挫傷局部皮膚完整，皮下出血、腫脹，鏡下見骨骼肌局部出血、水腫。傷后6 h鏡下見部分骨骼肌間質(zhì)水腫出血，肌細胞胞漿均質(zhì)化，橫紋不清。傷后12 h～1 d，挫傷局部皮下出血緩解，鏡下見挫傷處骨骼肌間質(zhì)較多的炎細胞浸潤，肌細胞胞漿明顯均質(zhì)化，橫紋消失。傷后3 d鏡下見新生骨骼肌出現(xiàn)，間質(zhì)出血及水腫減輕。傷后7 ～14 d，挫傷局部已無明顯出血及水腫現(xiàn)象，鏡下見新形成的肌細胞明顯增多，炎細胞基本消失。傷后14 d可觀察到新生骨骼肌與周邊肌纖維融合。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 bFGF表達情況 對照組大鼠相應(yīng)部位骨骼肌細胞未見bFGF陽性表達。實驗組大鼠骨骼肌細胞在傷后6 h時見bFGF陽性表達，并逐漸升高，于傷后7 d陽性細胞率達到峰值，之后陽性表達逐漸減弱。傷后14 d，仍然可見bFGF陽性表達的骨骼肌細胞(圖1)。bFGF陽性反應(yīng)主要位于骨骼肌細胞胞漿外周和肌膜。

圖1 骨骼肌挫傷后bFGF免疫組化染色結(jié)果(SABC×400)

2.2.2 c-Fos表達情況 對照組大鼠相應(yīng)部位骨骼肌細胞未見c-Fos陽性表達。實驗組大鼠骨骼肌細胞在傷后0.5 h可見c-Fos陽性表達。隨著損傷時間的延長，骨骼肌細胞中c-Fos表達逐漸增強，c-Fos陽性細胞率逐漸升高，挫傷后3 h時達到峰值，之后呈下降趨勢。挫傷后14 d，大鼠骨骼肌細胞內(nèi)c-Fos陽性表達消失(圖2)。c-Fos陽性反應(yīng)主要位于骨骼肌細胞胞漿內(nèi)。

圖2 骨骼肌挫傷后c-Fos免疫組化染色結(jié)果(SABC×400)

2.3 bFGF與c-Fos陽性細胞率比值的變化

實驗組陽性細胞率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。bFGF與c-Fos陽性細胞率的比值呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢，骨骼肌挫傷后0.5～3 h，c-Fos陽性細胞率升高，但bFGF尚未出現(xiàn)陽性表達，二者陽性細胞率的比值為0；傷后3 h～1 d二者均存在陽性表達，但bFGF陽性細胞率低于c-Fos陽性細胞率，二者陽性細胞率比值在0～1.22。傷后1～14 d，bFGF陽性細胞率開始高于c-Fos，且差值逐漸加大，二者陽性細胞率比值>1.22并持續(xù)上升(表1)。

3 討論

3.1 bFGF陽性表達與骨骼肌損傷時間的關(guān)系

bFGF在正常骨骼肌細胞內(nèi)不表達或僅微弱表達，而當(dāng)骨骼肌受到損傷后其表達增加并發(fā)揮生物學(xué)功能。劉秀娟[10]研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌在過度運動造成損傷后，bFGF mRNA表達明顯增強；研究[11]同樣表明骨骼肌在較大強度鍛煉后bFGF mRNA表達水平顯著升高；徐明明等[12]研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌挫傷后，bFGF平均光密度值變化存在一定時序性。但目前尚未見將bFGF作為一種生化指標(biāo)用以判斷骨骼肌損傷時間的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)bFGF在骨骼肌挫傷后0～3 h未見表達，傷后6 h出現(xiàn)陽性表達信號，傷后7 d達到峰值，7 d后bFGF表達水平逐漸下降。本研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌挫傷后bFGF表達變化存在隨損傷時間變化的規(guī)律性，但單獨憑借其變化規(guī)律無法推斷骨骼肌損傷的時間范圍。

表1 bFGF、c-Fos陽性細胞率及二者比值的變化

注：①表示同對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；②表示同相鄰上一組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

3.2 c-Fos陽性表達與骨骼肌損傷時間的關(guān)系

c-Fos基因的蛋白產(chǎn)物可參與機體應(yīng)激反應(yīng)，在損傷后對機體具有保護作用[13]。閆紅濤等[3]研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌損傷后15 min即可檢見c-Fos蛋白陽性信號，1 h達到高峰，之后呈下降趨勢，1 d后恢復(fù)正常。本研究結(jié)果提示骨骼肌挫傷后0.5 h出現(xiàn)c-Fos陽性表達，表達信號逐漸增強，于3 h時達到最高點，之后其表達逐漸減弱，傷后14 d時，c-Fos陽性表達信號已消失。本研究結(jié)果的表達變化趨勢與之前學(xué)者的研究結(jié)果相似[3]。本研究發(fā)現(xiàn)c-Fos表達變化同樣存在時序性規(guī)律，但僅憑借該變化規(guī)律同樣無法推斷骨骼肌損傷的時間范圍。

3.3 bFGF、c-Fos陽性細胞率比值與骨骼肌損傷時間的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示當(dāng)bFGF和c-Fos的陽性細胞率比值為0，c-Fos陽性細胞率升高但bFGF未見陽性表達時，可推測骨骼肌損傷的時間在0.5 ～3 h；當(dāng)bFGF和c-Fos的陽性細胞率比值>0但<1.22時，二者均出現(xiàn)陽性表達，但c-Fos陽性細胞率高于bFGF，此時可以推測骨骼肌損傷時間在3 h～1 d；當(dāng)bFGF和c-Fos的陽性細胞率比值>1.22時，二者陽性細胞率均呈下降趨勢，且bFGF陽性細胞率始終高于c-Fos，故此時難以推測骨骼肌損傷的時間范圍。

綜上所述，本研究表明采用兩種表達時間存在先后差異的生化指標(biāo)，通過二者陽性細胞率比值的時序性改變并結(jié)合二者各自陽性細胞率的變化情況，可推斷骨骼肌挫傷的損傷時間。