肖玉菲，陳博雯，覃子海，覃玉鳳，晏 巢，劉海龍*

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600)

大百合(Cardiocrinumgiganteum)為百合科(Liliaceae )大百合屬(Cardiocrinum)多年生草本植物[1]，我國大百合主要分布在云南、西藏、四川、陜西、湖北、河南等地，其中四川是我國大百合分布最密集的地方[2]，其鱗莖富含淀粉等10余種營養(yǎng)成分[3]，可作藥食兩用，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

大百合種子繁殖所用周期較長，從萌發(fā)到形成商品球需3～4年[4]；鱗片扦插繁殖常攜帶病菌，難以在短時(shí)間內(nèi)獲得無菌苗；傳統(tǒng)的分球繁殖，會導(dǎo)致鱗莖逐年變小而退化，繁殖速度緩慢，不能滿足市場需求[5]。采用組織培養(yǎng)技術(shù)，既可以良好地保存百合的種質(zhì)資源，有效地保證遺傳的穩(wěn)定性[6]，又可以使繁殖速度大大增加[7]，對于其大規(guī)模推廣、應(yīng)用具有重要意義。然而，我國對大百合這一珍貴野生植物資源的開發(fā)剛剛起步，目前對野生大百合的研究多集中于其資源概況[8]、營養(yǎng)成分[9]、栽培[10]、生物多樣性[11]等方面，有關(guān)其組織培養(yǎng)技術(shù)的研究甚少[12-13]，且尚未形成規(guī)?；a(chǎn)的技術(shù)體系。本文以大百合鱗莖作為試驗(yàn)材料，研究了培養(yǎng)基、激素配比、蔗糖濃度和光照強(qiáng)度對于鱗莖誘導(dǎo)出芽的影響，旨在為其組培快繁體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以大百合鱗莖作為供試材料，均采自湖南省邵陽市新寧縣，保存于4 ℃冰箱中。試驗(yàn)前剪除大百合鱗莖根系，剝除最外層腐爛、褐化、帶病斑的鱗莖，用自來水沖洗鱗莖間泥土，輕輕地將鱗莖逐層剝離，保留部分鱗莖盤。選擇靠近鱗莖盤位置的中層鱗莖作為外植體，置于洗潔精溶液中浸泡5 min，其間不斷擦洗、攪動(dòng)，流水沖洗干凈后用75%酒精消毒1 min，超純水沖洗4～5遍，置于超凈工作臺上，再用0.1%升汞消毒8～12 min，無菌水沖洗4～5遍，將消毒后的外植體切成1.0～1.5 cm2大小，用消毒后的濾紙吸干浸出液和水分備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基篩選試驗(yàn) 分別選擇MS、WPM、B5、N6、White和Nitsch作為基本培養(yǎng)基，并附加一定濃度的激素和蔗糖(6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ZT 0.08 mg/L+蔗糖30 g/L)[12]進(jìn)行試驗(yàn)對比，每瓶接種1個(gè)鱗莖塊，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)8周后觀察并記錄鱗莖誘導(dǎo)情況。培養(yǎng)基pH值調(diào)為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，日光燈光源，光照時(shí)間12～14 h/d，光照強(qiáng)度1500～2000 lx。

1.2.2 激素配比試驗(yàn) 選擇MS作為基本培養(yǎng)基附加不同濃度的激素6-BA、NAA、IBA、KT和ZT，蔗糖濃度為30 g/L，具體處理見表1。每瓶接種1個(gè)鱗莖塊，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)8周后觀察并記錄鱗莖誘導(dǎo)情況。培養(yǎng)基pH值調(diào)為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，日光燈光源，光照時(shí)間12～14 h/d，光照強(qiáng)度1500～2000 lx。

1.2.3 蔗糖濃度試驗(yàn) 以MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ZT 0.08 mg/L為培養(yǎng)基，蔗糖濃度設(shè)置15、30、45 g/L共3個(gè)處理，每瓶接種1個(gè)鱗莖塊，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)基pH值調(diào)為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，日光燈光源，光照時(shí)間12～14 h/d，光照強(qiáng)度1500～2000 lx。培養(yǎng)3周起每隔1周統(tǒng)計(jì)鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)率和出芽率，培養(yǎng)8周后觀察并記錄鱗莖誘導(dǎo)情況。

1.2.4 光照強(qiáng)度試驗(yàn) 以前4周以MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖45 g/L為培養(yǎng)基，之后以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖15 g/L為培養(yǎng)基，采用暗培養(yǎng)(完全黑暗條件)、光培養(yǎng)(光照時(shí)間12～14 h/d，光照強(qiáng)度1500～2000 lx)和兩者結(jié)合3種方式進(jìn)行培養(yǎng)。A：接種后一直暗培養(yǎng)；B：接種后一直光培養(yǎng)；C：接種后先暗培養(yǎng)4周，再進(jìn)行光培養(yǎng)。每瓶接種1個(gè)鱗莖塊，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)基pH值調(diào)為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，培養(yǎng)8周后觀察并記錄鱗莖誘導(dǎo)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=誘導(dǎo)愈傷組織鱗莖數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

出芽率/%=誘導(dǎo)成芽鱗莖數(shù)/誘導(dǎo)愈傷組織鱗莖數(shù)×100

平均出芽數(shù)=出芽數(shù)總和/出芽鱗莖數(shù)。

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和因素內(nèi)多重比較并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對鱗莖誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)8周后統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基上大百合鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)率、出芽率和平均出芽數(shù)，結(jié)果見圖1。WPM、White和Nitsch 3種培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率、出芽率和平均出芽數(shù)均低于MS、B5和N6培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高為81.11%，N6出芽率最高，為58.2%，但與MS培養(yǎng)基的差異不是特別明顯，但在出芽數(shù)方面，MS培養(yǎng)基(6.32個(gè))顯著高于N6(4.51個(gè))和B5(2.83個(gè))培養(yǎng)基，故綜合分析，MS較適合作為大百合鱗莖誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響

2.2 激素配比對鱗莖誘導(dǎo)的影響

由表1可知，不同激素配比對于大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響差異顯著。對比處理1和處理2，愈傷組織的誘導(dǎo)率、出芽率和平均出芽數(shù)差異均不明顯，說明ZT對于大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響不是很大，而ZT價(jià)格較貴，可直接選擇6-BA與NAA組合。對比處理2和處理3，由此可知，NAA相比IBA更有利于愈傷組織誘導(dǎo)，但相同濃度的IBA更有利于出芽。對比處理1和處理4，說明KT在大百合鱗莖誘導(dǎo)方面效果不如6-BA明顯。對比處理3和處理7，處理5和處理6可知，降低6-BA濃度，愈傷組織誘導(dǎo)率下降，但出芽率和出芽數(shù)增加。對比處理7、8和9可知，在一定范圍內(nèi)增加IBA濃度，出芽率和出芽數(shù)增加，但當(dāng)IBA增加到1 mg/L時(shí)，出芽數(shù)雖然會增加，但增加效果并不明顯，而且出芽率會明顯降低。綜合分析可知，較高濃度的6-BA(5 mg/L)+較低濃度的NAA(0.1 mg/L)有利于愈傷組織的形成，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)(81.11%)；較低濃度的6-BA(0.5 mg/L)+較高濃度的IBA(0.5 mg/L)更有利于出芽，出芽率為76.39%，平均出芽數(shù)為10.64個(gè)。所以，在大百合鱗莖誘導(dǎo)時(shí)，可以先用5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，然后再轉(zhuǎn)入0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織出芽。

表1 不同激素配比對大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后的小寫字母表示在0.05水平上的差異顯著性，字母不同則差異顯著，相同則不顯著。

2.3 蔗糖濃度對鱗莖誘導(dǎo)的影響

由圖2可知，大百合愈傷組織誘導(dǎo)開始的時(shí)間與蔗糖濃度關(guān)系不是很大，在培養(yǎng)3周時(shí)，均產(chǎn)生愈傷組織。大百合鱗莖誘導(dǎo)出芽時(shí)間與蔗糖濃度有關(guān)，蔗糖濃度越低，鱗莖出芽越早。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，出芽率和出芽數(shù)在不同蔗糖濃度處理間無明顯差異，但在愈傷組織誘導(dǎo)率方面，培養(yǎng)初期(5周之前)45 g/L蔗糖濃度處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，隨著時(shí)間增加，30 g/L蔗糖濃度處理的高于其他2種蔗糖濃度。因此，在大百合組鱗莖誘導(dǎo)過程中，可根據(jù)不同的培養(yǎng)基，選擇不同的蔗糖濃度，即在短期內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織時(shí)，可在培養(yǎng)基中添加45 g/L蔗糖；想要獲得大量的愈傷組織，可在培養(yǎng)基中添加30 g/L蔗糖；在后期誘導(dǎo)愈傷分化出芽時(shí)可降低蔗糖濃度到15 g/L。

圖2 蔗糖濃度對大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響

2.4 光照強(qiáng)度對鱗莖誘導(dǎo)的影響

由圖3可知，3種培養(yǎng)方式對于愈傷組織誘導(dǎo)影響差異不明顯，主要影響出芽效果。完全暗培養(yǎng)(A)的出芽率和出芽數(shù)較低，完全光培養(yǎng)(B)的愈傷組織誘導(dǎo)率較低，但出芽率和出芽數(shù)較完全暗培養(yǎng)有所增加，先進(jìn)行暗培養(yǎng)然后再進(jìn)行光培養(yǎng)(C)的不僅愈傷組織誘導(dǎo)率最高，而且出芽率和出芽數(shù)均最高，是大百合鱗莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)方式。

3 討論與結(jié)論

目前，有關(guān)大百合組織培養(yǎng)的研究相對較少，多數(shù)研究直接采用MS作為基本培養(yǎng)基，尚未見比較不同培養(yǎng)基對于其鱗莖誘導(dǎo)出芽的影響研究。而不同植物對營養(yǎng)水平的要求不同[14-18]，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽成分、源的存在方式對植物組培影響較大，只有恰當(dāng)?shù)腘O3-/NH4+比，才更有利于細(xì)胞的生長[16]。本試驗(yàn)比較了6種常用培養(yǎng)基對大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)MS較適合作為大百合鱗莖誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基。

激素對組織和細(xì)胞的增殖、分化等均起著關(guān)鍵的作用[17]，培養(yǎng)物對激素的需要量取決于其自身內(nèi)源激素的水平，而這一水平隨植物種類、組織的部位等條件變動(dòng)[19]，故在植物組織培養(yǎng)過程中，通常需要進(jìn)行激素種類和濃度的配比篩選試驗(yàn)，常用的激素主要有6-BA、KT、IAA、NAA、IBA等[20-21]。在大百合鱗莖誘導(dǎo)的報(bào)道中，多數(shù)研究者只將6-BA和NAA用來配比，而對于其他激素的作用，在大百合鱗莖誘導(dǎo)時(shí)罕見報(bào)道。本研究對比了常用的5種激素的效果發(fā)現(xiàn)，6-BA與KT對大百合鱗莖的誘導(dǎo)和不定芽的形成都有促進(jìn)作用，但KT的作用效果不如6-BA明顯，這與路艷等[5]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，本試驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)：6-BA的濃度對于愈傷組織誘導(dǎo)和出芽的影響較關(guān)鍵，高濃度的6-BA有利于誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但出芽效果不夠理想；低濃度的6-BA雖然愈傷組織誘導(dǎo)率不高，但更有利于誘導(dǎo)出芽。張彥妮[22]和林貴美[23]等研究6-BA對百合組培的影響時(shí)，也提出了高濃度的6-BA會抑制不定芽的產(chǎn)生，與本研究結(jié)果類似。

圖3 光照強(qiáng)度對大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響

植物組織培養(yǎng)不僅受到激素的影響，還有其他一些因子也會發(fā)揮作用，如蔗糖[24]和光照[25]等。多數(shù)學(xué)者研究時(shí)將蔗糖作為了一個(gè)固定的量來試驗(yàn)，而蔗糖是培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑，在組培的不同階段濃度要求不同。本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)蔗糖濃度發(fā)現(xiàn)，在相對較短時(shí)間內(nèi)獲得愈傷組織可以添加較高的蔗糖濃度，在出芽階段應(yīng)該降低蔗糖濃度。此外，大量研究表明：光照對植物組織培養(yǎng)具有重要作用[26]，本研究發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)度對于出芽效果影響較明顯，在大百合鱗莖誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)選擇合適的光照進(jìn)行培養(yǎng)。

本試驗(yàn)對大百合鱗莖誘導(dǎo)的影響因素進(jìn)行研究，綜合分析得出以下結(jié)論：MS是較適合的基本培養(yǎng)基，前4周以MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖45 g/L為培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，同時(shí)采用暗培養(yǎng)，之后以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖15 g/L為培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織分化出芽，采用光培養(yǎng)，日照時(shí)間12～14 h/d，光照強(qiáng)度1500～2000 lx，此種誘導(dǎo)培養(yǎng)方式可使誘導(dǎo)率達(dá)到88.89%，出芽率達(dá)到93.82%，平均出芽數(shù)達(dá)到12.3。