施春暉，王曉慶，張學(xué)英，駱 軍*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 林木果樹(shù)研究所，上海 201403；2.上海市設(shè)施園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403)

砂梨果皮的顏色可分為3種類型：全銹色、半銹色和綠色[1-2]。翠冠是典型半銹色中國(guó)砂梨品種，具有產(chǎn)量高、質(zhì)量好的特點(diǎn)。但外果皮顏色不均一，覆蓋了一層不均勻的木栓層，而消費(fèi)者并不喜歡不美觀的果實(shí)外觀。翠冠的栽培面積已占全國(guó)梨面積的8%左右[3]。南方砂梨品種優(yōu)，但由于外果皮銹斑而嚴(yán)重影響其外觀品質(zhì)，從而阻礙了南方半銹砂梨向全國(guó)大面積的推廣。因此，提升半銹砂梨外觀品質(zhì)是當(dāng)務(wù)之急。

具有銹色的外果皮是木栓層覆蓋在綠色或黃色底色上導(dǎo)致的。在梨果的實(shí)發(fā)育過(guò)程中，果皮角質(zhì)層和表皮細(xì)胞破損后積累的木栓層形成梨果皮繡斑(褐色)，木質(zhì)素(Lignin)是木栓層的重要成分[4-5]。因此木質(zhì)素的積累與梨果皮繡斑(褐色)的形成有關(guān)[6]。木質(zhì)素是一類苯丙烷類聚合物，是植物細(xì)胞壁次生加厚過(guò)程中形成的重要物質(zhì)，木質(zhì)素參與木栓層的形成。木栓質(zhì)被發(fā)現(xiàn)是一種普遍存在的不溶性高分子聚酯由兩聚一聚酚類和脂肪族結(jié)構(gòu)域(SPPD為木栓質(zhì)聚酚域；SPAD為木栓質(zhì)聚脂肪族結(jié)構(gòu)域)[7-9]。對(duì)銹色果皮和綠色果皮突變體之間的生化物質(zhì)的比較分析也表明：木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量可高于綠色果皮的[10-12]。PAL酶是催化其代謝反應(yīng)第一步的酶，PAL的表達(dá)直接影響整個(gè)合成過(guò)程,當(dāng)PAL含量增加后，木質(zhì)素含量明顯增多；當(dāng)PAL酶活性下降時(shí)，植物中的木質(zhì)素含量下降[13-15]。CCoAOMT在植物木質(zhì)素合成中對(duì)G木質(zhì)素特意調(diào)控,研究均表明：CCoAOMT的表達(dá)活性與木質(zhì)素含量密切相關(guān)。不同的下游分支代途徑代謝增強(qiáng)都會(huì)引起苯丙氨酸代謝的加劇,木質(zhì)素合成途徑就是苯丙氨酸下游的代謝途徑之一。張?jiān)迫A等[16]研究木質(zhì)素合成相關(guān)的PPO和POD酶活性與果皮褐色明顯相關(guān)。

目前，生產(chǎn)上利用套袋技術(shù)可消除或減輕銹斑。張勃等通過(guò)對(duì)黃冠梨套袋研究果實(shí)銹斑隨套袋時(shí)期推遲而減少，另外,不同的果袋對(duì)果實(shí)表面銹斑也有影響,對(duì)黃冠梨的研究表明，套雙層袋果實(shí)的銹斑指數(shù)與不套袋相近,套單層袋和單條紋紙袋袋內(nèi)溫度相對(duì)較低，相對(duì)濕度也低于雙層袋和對(duì)照,抑制了果皮木栓形成層的活動(dòng),減輕了果實(shí)銹斑的形成和發(fā)育[17]。玻璃紙和牛皮紙促進(jìn)了果點(diǎn)和果銹的形成,而蠟紙顯著地抑制果點(diǎn)的木栓化,報(bào)紙袋提早果面木栓化,促進(jìn)果銹的形成[5,18]。目前，關(guān)于套袋對(duì)梨果發(fā)育期到成熟期木質(zhì)素積累及木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶活性變化影響的研究較少。

本研究以半銹砂梨為翠冠為試材，不套袋處理為對(duì)照，通過(guò)對(duì)套袋梨果實(shí)的褐斑指數(shù)、木質(zhì)素含量、木質(zhì)素代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定，比較分析了套袋后外果皮褐斑的發(fā)生機(jī)理，深入探討了果皮褐色的形成機(jī)理，為今后提高砂梨果實(shí)的外觀品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2016年在上海金冠蜜梨種植園(30.92° N，121.47° E)中開(kāi)展套袋試驗(yàn)。土壤為粘壤土，年平均氣溫15.7 ℃，年平均降水量1178.2 mm。半銹色中國(guó)砂梨12年生翠冠果實(shí)為試材，盛花后5 d套袋，觀測(cè)取盛花后10 d到成熟期(盛花后120 d)分為10個(gè)階段，從果實(shí)發(fā)育早期到中期，果實(shí)樣品每10 d取樣1次，近成熟期果實(shí)樣品每20 d取樣1次。

1.2 方法

選擇12年樹(shù)齡生長(zhǎng)健壯、樹(shù)勢(shì)一致，負(fù)載量相近的翠冠樹(shù)8株，標(biāo)記掛牌。分別在每棵樹(shù)上隨機(jī)套白色小林袋60個(gè)，不套袋的果實(shí)作為對(duì)照，重復(fù)3次。果實(shí)發(fā)育早期(花后10～80 d)，木栓層變化顯著，每10 d取樣1次；花后80～120 d，每20 d取樣1次，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室并削下果實(shí)中部外果皮液氮冷凍后，磨成細(xì)粉后待測(cè)定。

1.2.1 果銹指數(shù)統(tǒng)計(jì) 參照J(rèn)ones等[19]的方法略有改進(jìn)，由于砂梨銹斑的覆蓋率高，即根據(jù)果銹程度將果實(shí)分為8級(jí)：無(wú)銹果為0級(jí)，果銹面積1%～5%為1級(jí)，6%～10%為2級(jí)，11%～15%為3級(jí)，16%～20%為4級(jí)，21%～40%為5級(jí)，41%～60%為6級(jí)，61%～80%為7級(jí)，81%～100%為8級(jí)。

果銹指數(shù)=[∑(各級(jí)代表數(shù)值×該級(jí)果數(shù))]/(總果數(shù)×最重級(jí)代表數(shù)值)×100。

1.2.2 外果皮褐斑的顯微結(jié)構(gòu)觀察 盛花后10～120 d利用體視顯微鏡(放大10倍)觀察翠冠梨的外果皮木栓層形成過(guò)程并拍照。

1.2.3 木質(zhì)素含量 采用Morrison[20]的木質(zhì)素測(cè)定方法測(cè)定木質(zhì)素含量。

1.2.4 木質(zhì)素合成代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定 苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)的提取和活性測(cè)定參照Dyckmans等[21]的方法測(cè)定，稍做修改。果肉4.0 g，加10 mL含5 mmol/L的巰基乙醇的硼酸緩沖液、0.5 g PVP，加少量石英砂研磨成勻漿，在4 ℃下，10000 r/min離心15 min，上清液為粗酶液。活性測(cè)定的反應(yīng)體系為4 mL，含1 mL酶液、1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸、2 mL蒸餾水，以不加底物為對(duì)照，40 ℃水浴1 h后，在波長(zhǎng)290 nm處測(cè)定溶液吸光度值，以每小時(shí)吸光度變化0.001所需酶量為1個(gè)酶活性單位。

4-香豆酸輔酶A連接酶活性的測(cè)定(4-hydroxycinnamate co-A ligase，4CL)參照Knobloch等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定。

肉桂酸羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)酶活性測(cè)定參考陳雷等[23]的方法進(jìn)行測(cè)定。

肉桂醇脫氫酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)活性的肉桂醇脫氫酶(CAD)活性測(cè)定參照Goffner等[24]方法進(jìn)行測(cè)定。

過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)活性的測(cè)定參照Cai等[25]的方法進(jìn)行測(cè)定。樣品取樣1 g,加8 mL(0.05 mol/L、pH 5.5)PBS,冰浴研磨,在4 ℃下，10000 r/min離心10 min,取上清液定容于25 mL容量瓶中。反應(yīng)體系：2.9 mL(0.05 mol/L、pH 5.5)PBS,1.0 mL 2% H2O2,1.0 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚和0.1 mL酶液,對(duì)照管加0.1 mL死酶液。在波長(zhǎng)470 nm下比色。以O(shè)D470變化1.0為1個(gè)酶活性單位,酶活性表示為ΔOD470/(g·min)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理和處理采用Excel 2003軟件，數(shù)據(jù)相關(guān)性分析用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 套袋對(duì)翠冠梨外果皮結(jié)構(gòu)影響的動(dòng)態(tài)變化

外果皮的果銹實(shí)質(zhì)是木栓層的沉著,在盛花后10 d對(duì)果實(shí)套袋，整個(gè)果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中木栓層的形成速度明顯減緩。由圖1可知，從外觀上看，套袋和不套袋果實(shí)發(fā)育到成熟期的動(dòng)態(tài)觀測(cè)中，盛花后50 d即果實(shí)快速膨大期之前，外果皮顏色均為綠色，木栓層的發(fā)生時(shí)間存在明顯差異。盛花后50 d套袋果實(shí)外果皮除氣孔處褐色木栓化外果皮較為潔凈，直到盛花后60 d套袋果實(shí)外果皮才有明顯的褐色木栓層，而不套袋的果實(shí)在盛花后30 d外果皮上已近出現(xiàn)點(diǎn)狀銹斑。盛花后70 d，果實(shí)進(jìn)入快速膨大期，外果皮木栓層面積隨著果實(shí)迅速發(fā)育而迅速擴(kuò)大，但此時(shí)套袋的果實(shí)仍以綠色為主，而不套袋的果實(shí)外果皮絕大多數(shù)被木栓層覆蓋，表現(xiàn)為淺褐色。隨后木栓層隨著發(fā)育進(jìn)程而迅速擴(kuò)大，套袋果實(shí)外果皮木栓層覆蓋始終較慢，且木栓層顏色變深較慢，直到成熟期外果皮雖有銹斑但顏色淺且仍可見(jiàn)大面積的綠色底色，相比較不套袋的果實(shí)盛花后80 d，其外果皮基本被褐色木栓層覆蓋且顏色逐漸加深，成熟時(shí)深褐色銹斑幾乎完全覆蓋外果皮。

利用顯微鏡觀察套袋和不套袋果實(shí)外果皮結(jié)構(gòu)的變化，由圖1可知，木栓層微觀結(jié)構(gòu)的變化早于外觀的變化。果點(diǎn)發(fā)生在幼果發(fā)育初期且早于銹斑的發(fā)生，套袋后果點(diǎn)的形成進(jìn)程也會(huì)顯著減緩，不套袋的果實(shí)外果皮在盛花后10 d就進(jìn)入了皮孔期，即氣孔明顯下限與表皮細(xì)胞內(nèi)形成圓錐結(jié)構(gòu)，圓錐體內(nèi)部處于亞表皮細(xì)胞恢復(fù)分裂能力形成木栓層。套袋后20 d，果實(shí)外果皮才逐漸進(jìn)入皮孔期，而此時(shí)不套袋的外果皮已進(jìn)入了果點(diǎn)形成期，即木栓化了的填充細(xì)胞呈黃褐色，且撐破周圍的表皮，逐漸填滿空腔，形成果點(diǎn)。盛花30 d后，套袋與不套袋的外果皮均進(jìn)入果點(diǎn)膨大期，不套袋果實(shí)果點(diǎn)不僅迅速膨大，而且外果皮角質(zhì)膜出現(xiàn)龜裂少量表皮細(xì)胞發(fā)生木栓化。套袋后果實(shí)盛花后50 d，外果皮才出現(xiàn)角質(zhì)膜龜裂表皮細(xì)胞木栓化的現(xiàn)象，此后外果皮表皮細(xì)胞繼續(xù)木栓化，但木栓化程度及速度始終慢于不套袋的果實(shí)。盛花后70 d，果實(shí)進(jìn)入快速膨大期，外果皮木栓化面積隨著果實(shí)發(fā)育角質(zhì)膜龜裂迅速擴(kuò)大，并且木栓化細(xì)胞逐漸加深，不同的是套袋果實(shí)外果皮果點(diǎn)木栓化顏色較不套袋的顏色深，但表皮細(xì)胞的木栓化程度輕于不套袋，而且發(fā)展速度緩慢。盛花后120 d,成熟期的套袋果實(shí)外果皮的木栓化程度與不套袋果實(shí)盛花后50～60 d的相近。

2.2 套袋對(duì)翠冠梨外果皮褐斑指數(shù)的影響

果實(shí)銹斑指數(shù)是衡量外果皮銹斑覆蓋程度的標(biāo)志性參數(shù)。由圖2可知，翠冠果實(shí)外果皮隨著果實(shí)發(fā)育，褐斑指數(shù)呈上升的趨勢(shì)，幼果期上升較緩慢，盛花后70 d果實(shí)迅速膨大期，果實(shí)銹斑指數(shù)顯著上升。套袋果實(shí)與不套袋(對(duì)照)果實(shí)相比，果實(shí)全發(fā)育期果實(shí)銹斑指數(shù)趨勢(shì)一致，但上升幅度顯著低于不套袋(對(duì)照)果實(shí)。與不套袋對(duì)照相比，套袋果實(shí)在幼果期即盛花后10～20 d，果銹未形成期果銹指數(shù)差異不顯著，盛花后30 d不套袋果實(shí)外果皮角質(zhì)膜的龜裂表皮細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生木栓化，果銹指數(shù)高于套袋11.67%。盛花后60 d果實(shí)迅速膨大期前，套袋果實(shí)果銹指數(shù)低于不套袋(對(duì)照)果實(shí)的果銹指數(shù)16.9%。盛花后70 d果實(shí)迅速膨大期,套袋果實(shí)果銹指數(shù)上升顯著低于不套袋(對(duì)照)，這一時(shí)期也是它們之間果銹差異最大的時(shí)期，套袋果實(shí)果銹指數(shù)較不套袋(對(duì)照)低41.67%，盛花后100 d果實(shí)逐漸進(jìn)入成熟期，兩者仍差異顯著，但幅度小于盛花后70 d。

圖1 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮褐斑影響的表觀及顯微觀測(cè)

2.3 套袋對(duì)翠冠梨外果皮木質(zhì)素含量的影響

木質(zhì)素是木栓層木栓質(zhì)聚酚域SPPD的主成分，如圖3所示，盛花后10～120 d,翠冠外果皮木質(zhì)素的含量隨著果實(shí)發(fā)育呈上升的趨勢(shì)，盛花后各個(gè)時(shí)期，套袋后果實(shí)外果皮的木質(zhì)素含量均低于不套袋的果實(shí)，盛花后60 d果實(shí)成熟之前,套袋果實(shí)外果皮木質(zhì)素略低于不套袋(對(duì)照)木質(zhì)素含量，且差異不顯著；盛花后70～80 d果實(shí)迅速膨大期，套袋與不套袋(對(duì)照)外果皮木質(zhì)素含量差異顯著，不套袋(對(duì)照)外果皮在這2個(gè)時(shí)期木質(zhì)素含量高于套袋外果皮的15.56%和35.01%，盛花后100 d,兩者差距逐漸縮小，但套袋后外果皮木質(zhì)素含量仍低于不套袋(對(duì)照)外果皮的。

圖2 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮褐斑指數(shù)的影響

圖3 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮木質(zhì)素含量的影響

2.4 套袋對(duì)翠冠梨外果皮木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶活性的影響

2.4.1 套袋對(duì)翠冠梨外果皮苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響 由圖4可知，翠冠梨果實(shí)外果皮PAL，酶活性在整個(gè)生育期呈先上升后下降的趨勢(shì)。盛花后10～120 d套袋后果實(shí)外果皮PAL活性低于不套袋果實(shí)的PAL活性，盛花后30～40 d套袋與不套袋(對(duì)照)果實(shí)外果皮PAL酶活性均達(dá)到最大，此后開(kāi)始下降，但兩者的差異在盛花后50 d左右最為顯著，不套袋(對(duì)照)果實(shí)外果皮PAL活性是套袋外果皮PAL酶活性的2.13倍。幼果發(fā)育期和果實(shí)成熟期兩者的酶活性差異最小。

2.4.2 套袋對(duì)翠冠梨外果皮4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)活性的影響 翠冠梨外果皮的4CL酶活性在整個(gè)果實(shí)生育期呈雙S曲線，在盛花后30～40 d顯著上升后顯著下降，盛花后70 d后小幅上升后下降。由圖5可知，在整個(gè)生育期，套袋后的果實(shí)外果皮4CL活性低于不套袋(對(duì)照)。盛花后10～20 d,套袋梨果實(shí)外果皮4CL酶活性和不套袋(對(duì)照)差異不顯著；盛花后30～60 d,幼果發(fā)育期即果實(shí)迅速膨大前套袋梨果實(shí)外果皮4CL酶活性比不套袋(對(duì)照)低71.43%～75.00%；僅在盛花后70 d和120 d,套袋后果實(shí)外果皮4CL活性高于不套袋果實(shí)，但盛花后80 d套袋比不套袋(對(duì)照)外果皮4CL酶活性低120%，且差異極顯著。

圖4 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮PAL酶活性的影響

圖5 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮4CL酶活性的影響

2.4.3 套袋對(duì)翠冠梨外果皮肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)活性的影響 C4H酶活性在翠冠梨果實(shí)外果皮內(nèi)的活性變化見(jiàn)圖6，隨著果實(shí)的發(fā)育呈先上升后下降的趨勢(shì)，下降后的酶活性緩慢降低，套袋與不套袋(對(duì)照)在盛花后30～40 d顯著上升后急劇下降，在這段時(shí)期套袋果實(shí)的外果皮C4H酶活性顯著低于不套袋(對(duì)照)，分別比對(duì)照低43.19%和57.45%。其他各時(shí)期套袋和不套袋(對(duì)照)外果皮C4H酶活性相比時(shí)而略高時(shí)而略低，但差異不顯著。

2.4.4 套袋對(duì)翠冠梨外果皮肉桂醇脫氫酶(CAD)活性的影響 由圖7可知，隨著幼果發(fā)育翠冠梨果實(shí)外果皮CAD酶活性變化趨勢(shì)平緩，僅在盛花后50 d有小幅的上升，直到盛花后70 d果實(shí)進(jìn)入迅速膨大期后CAD活性出現(xiàn)顯著上升，盛花后80 d的CAD活性達(dá)到最大，盛花后100 d趨于成熟期，CAD酶活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)。在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期，套袋梨果實(shí)外果皮CAD活性始終低于不套袋果實(shí)外果皮的CAD活性，其中在兩者在盛花后30、70、100 d差值大于10 U/g FW。

圖6 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮C4H酶活性的影響

圖7 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮CAD酶活性的影響

2.4.5 套袋對(duì)翠冠梨外果皮過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響 翠冠梨果實(shí)外果皮中的POD酶活性在整個(gè)果實(shí)生育期呈雙S曲線。由圖8可知，在盛花后10～60 d顯著上升后顯著下降，盛花后40 d達(dá)到第1個(gè)小高峰；盛花后60～120 d先顯著上升后顯著下降。在剛套袋后果實(shí)POD酶活性顯著低于不套袋(對(duì)照)果實(shí)外果皮，此后幼果發(fā)育期兩者差異不顯著，盛花后70～120 d即果實(shí)膨大期至果實(shí)成熟期套袋的翠冠梨果實(shí)外果皮的POD活性極顯著低于不套袋的果實(shí)。

圖8 翠冠梨果實(shí)發(fā)育期套袋對(duì)外果皮POD酶活性的影響

2.4.6 翠冠梨外果皮木質(zhì)素含量與木質(zhì)素合成代謝關(guān)鍵酶的相關(guān)性分析 由表1可知，翠冠梨外果皮木質(zhì)素含量與PAL酶、4CL酶、C4H酶、CAD酶、POD酶均呈正相關(guān)性。不套袋的翠冠外果皮木質(zhì)素含量與CAD呈顯著正相關(guān)；PAL酶與4CL酶，C4H酶呈顯著正相關(guān)；4CL酶與C4H酶呈極顯著正相關(guān)。套袋后翠冠梨外果皮中PAL酶與4CL酶呈極顯著正相關(guān)；4CL酶與C4H酶呈顯著正相關(guān)。

表1 翠冠外果皮木質(zhì)素含量與木質(zhì)素代謝關(guān)鍵酶活性相關(guān)性分析

注：**表示極顯著相關(guān)；*表示顯著相關(guān)。對(duì)角線右上角數(shù)據(jù)為翠冠不套袋(對(duì)照)；左下角數(shù)據(jù)為翠冠套袋。

3 討論

翠冠梨屬于典型的半銹色砂梨，它的果銹實(shí)質(zhì)是果實(shí)外果皮覆蓋的一層木栓層，其形成原因主要是由于外界雨水等不利果實(shí)發(fā)育的環(huán)境影響，導(dǎo)致外果皮最外層角質(zhì)膜失去保護(hù)能力，下層表皮細(xì)胞木栓化逐漸覆蓋于外果皮形成褐斑[26-29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不套袋翠冠果實(shí)外果皮在盛花后30 d就形成一定面積的銹斑，這一結(jié)果比王慧等[30]認(rèn)為盛花后49 d后出現(xiàn)不規(guī)則銹斑斑點(diǎn)要早很多，這可能是試驗(yàn)環(huán)境差異導(dǎo)致其形成時(shí)間不一致。在盛花后10 d對(duì)翠冠幼果套白色油蠟紙制作的小林袋可有效延緩?fù)夤つ舅▽拥陌l(fā)生及發(fā)展進(jìn)程，套袋后顯微觀測(cè)盛花后50 d果實(shí)外果皮才出現(xiàn)表皮細(xì)胞木栓化，盛花后60 d肉眼才能觀測(cè)到褐斑小斑點(diǎn)。

果點(diǎn)是早期幼果皮孔處表皮細(xì)胞木栓化的結(jié)果，是否與果皮銹斑有關(guān)目前爭(zhēng)議較大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，翠冠梨果點(diǎn)與外果皮銹斑不存在因果關(guān)系，這一結(jié)果與施澤彬[31]的研究結(jié)果一致。套袋后翠冠果實(shí)銹斑明顯減輕但盛花后50 d果點(diǎn)的發(fā)展程度比不套袋對(duì)照強(qiáng)烈。

木栓質(zhì)是由木栓聚紛結(jié)構(gòu)域(SPPD)和木栓聚脂結(jié)構(gòu)域(SPAD)組成的大分子構(gòu)成，其中聚酚結(jié)構(gòu)域主要由羥基阿魏酸及其衍生物以類似木質(zhì)素單體形成木質(zhì)素的方式共價(jià)連接而成。因此，木質(zhì)素生物合成在銹斑形成中起至關(guān)重要的作用。李曉峰等在碭山梨褐皮芽變中發(fā)現(xiàn)，銹皮芽變外果皮木質(zhì)素合成代謝關(guān)鍵酶PAL、4CL、CAD以及POD酶活性均高于正常碭山梨外果皮。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：不套袋翠冠褐斑嚴(yán)重，它的外果皮中木質(zhì)素單體含量以及木質(zhì)素合成代謝關(guān)鍵酶活性，包括PAL酶、4CL酶、CAD酶、C4H酶的活性普遍高于套袋翠冠果實(shí)外果皮。然而有研究報(bào)道CAD酶基因得到抑制可能有助于褐色銹斑在外果皮上沉著[11-12]，而一些研究表明：CAD活性減低會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素前體物質(zhì)減少[32-33]。Moura等[34]認(rèn)為SPPD中木質(zhì)素前體的含量降低可能進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞壁松動(dòng)和膨脹利于銹斑的積累，最近筆者對(duì)半銹砂梨結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，即使外果皮角質(zhì)膜破裂痕較大，但如果表皮細(xì)胞木質(zhì)化程度低，外果皮銹斑較少(文章待發(fā)表)。推測(cè)果實(shí)銹斑不僅僅與機(jī)械膨脹擠壓力有關(guān)，可能與自身防御調(diào)控能力有關(guān)。

在相關(guān)分析中，套袋與不套袋(對(duì)照)結(jié)果顯示，兩者的木質(zhì)素與合成代謝酶的正相關(guān)性不一致，未完全達(dá)到顯著水平，木質(zhì)素生物合成PAL酶、C4H酶、4CL酶相關(guān)性較為顯著。畢竟翠冠果實(shí)銹斑形成機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的進(jìn)程，木質(zhì)素合成僅是銹斑形成的其中一個(gè)環(huán)節(jié)，整個(gè)褐斑的形成過(guò)程尚需進(jìn)一步研究。