唐玉玲，王昭華，霍彩云，郭曉桐，楊光輝，李穎鑫，王書揚(yáng)，田海燕，胡艷欣

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193)

流感病毒屬于正粘病毒科，流感病毒屬，是有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。其中A型流感病毒感染可導(dǎo)致人類和動(dòng)物嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，研究表明，高致病性A型流感病毒感染時(shí)，急性肺損傷并伴隨嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)是該病具有高死亡率的原因[1-2]。機(jī)體微循環(huán)系統(tǒng)遍布全身，微血管內(nèi)皮細(xì)胞在微循環(huán)系統(tǒng)中起著最主要的保護(hù)作用，其中腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞在腸道中廣泛分布，其是否可作為A型流感病毒感染的靶細(xì)胞，并借此經(jīng)胃腸道進(jìn)行感染，這些問題值得我們深入探究。本試驗(yàn)選取大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光染色方法定性檢測(cè)SAα2，3Gal和SAα2，6Gal受體的表達(dá)情況，并利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩種受體進(jìn)行定量分析，為進(jìn)一步了解流感病毒能否經(jīng)胃腸道感染的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RIM-MVECs)，由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 多聚賴氨酸包被液：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；Triton X-100： Sigma-Aldrich 產(chǎn)品；濃硫酸：北京化工廠產(chǎn)品；PBS(磷酸鹽緩沖液，pH值7.4)：北京邁晨科技有限公司產(chǎn)品；熒光素標(biāo)記植物凝集素：Vector Laboratories產(chǎn)品；BSA：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；4%中性甲醛：北京化學(xué)劑廠產(chǎn)品；中性樹膠：無錫江原實(shí)業(yè)技貿(mào)有限公司產(chǎn)品；DAPI： Roche產(chǎn)品；抗熒光淬滅劑：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液吸出加入培養(yǎng)皿中，輕晃混勻復(fù)蘇細(xì)胞。置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液。觀察培養(yǎng)皿中細(xì)胞的形態(tài)和密度，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好，密度約為90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 細(xì)胞爬片的制備 蓋玻片用濃硫酸和無水乙醇分別浸泡處理后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，處理后的細(xì)胞爬片置于多聚賴氨酸工作液中浸泡，室溫孵育10 min后取出，打開超凈臺(tái)紫外燈進(jìn)行滅菌，展開晾干。0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液充分吹打，使之形成單細(xì)胞懸液。將處理好的細(xì)胞爬片放進(jìn)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，根據(jù)需要的細(xì)胞密度接種單細(xì)胞懸液，每孔加入500 μL單細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 激光共聚焦定性檢測(cè)細(xì)胞表面唾液酸受體 去除陳舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，經(jīng)固定、透化、封閉后，直接加入帶熒光標(biāo)記的抗體即熒光素標(biāo)記的植物凝集素：FITC-MAA、FITC-SNA，室溫下孵育2～6 h。用DAPI染核，中性樹膠封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞表面唾液酸受體 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，加入1 mL DMEM轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，1 000 r/min(4 ℃)離心5 min。棄上清后加入1mL流式緩沖液漂洗1次，1 000 r/min(4 ℃)離心5 min。避光條件下，在離心管中加入200 μL稀釋好的、帶熒光標(biāo)記的植物凝集素FITC-MAA或FITC-SNA，重懸細(xì)胞，4 ℃條件下避光孵育1 h。離心管中加入1 mL流式緩沖液漂洗細(xì)胞1次，1 000 r/min(4 ℃)離心5 min，去上清。加入200 μL流式緩沖液，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面唾液酸受體的定性檢測(cè) 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果，如中插彩版圖1所示，SNA-FITC、MAA-FITC染色后均呈陽(yáng)性(綠色)，肉眼觀察SNA-FITC染色強(qiáng)度略高于MAA-FITC的染色強(qiáng)度。說明細(xì)胞表面既表達(dá)SAα2,6Gal又表達(dá)SAα2,3Gal，即同時(shí)表達(dá)人流感病毒受體和禽流感病毒受體，且受體表達(dá)量可能有所差異。

2.2 大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面唾液酸受體的定量檢測(cè) 為了進(jìn)一步定量分析大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面唾液酸受體的表達(dá)情況，按照本文1.6所示方法，分別用濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的SNA-FITC或MAA-FITC孵育細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。結(jié)果如中插彩版圖2所示，當(dāng)濃度為5 μg/mL時(shí)，MAA-FITC(SAα2,3Gal)染色陽(yáng)性細(xì)胞占70.5%，SNA-FITC(SAα2,6Gal)染色陽(yáng)性細(xì)胞占98%；當(dāng)使用更高濃度(10 μg/mL和20 μg/mL)進(jìn)行孵育時(shí)，MAA-FITC和SNA-FITC染色陽(yáng)性細(xì)胞均高于95%。平均熒光強(qiáng)度(Mean fluorescence intensity, MFI)隨著使用植物凝集素濃度的提高而提高，存在一定的濃度依賴性，當(dāng)濃度為5 μg/mL時(shí)，SNA-FITC的平均熒光強(qiáng)度為MAA-FITC的9.49倍，濃度為10 μg/mL 時(shí)為11.83倍，濃度為20 μg/mL時(shí)為12.14倍。上述結(jié)果與我們?cè)诩す夤簿劢怪腥庋塾^察到的結(jié)果一致，即SNA-FITC染色強(qiáng)度高于MAA-FITC，說明大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面SAa2,6Gal表達(dá)量高于SAa2,3Gal 的表達(dá)量。

3 討論

現(xiàn)階段科學(xué)研究表明，流感病毒感染宿主細(xì)胞的第一步是流感病毒表面的抗原決定簇血凝素蛋白與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合[3]。流感病毒的受體主要分為兩種：唾液酸α2,3半乳糖受體，其廣泛存在于人類的下呼吸道及禽類胃腸道，被認(rèn)為主要被禽流感病毒識(shí)別；唾液酸α2,6半乳糖受體，被認(rèn)為主要被人流感病毒識(shí)別[4]。唾液酸受體的種類和分布對(duì)于流感病毒的宿主范圍和發(fā)病機(jī)制的研究至關(guān)重要[5]。A型流感病毒通常是通過呼吸道感染哺乳動(dòng)物，然而有相關(guān)報(bào)道，通過消化道感染流感病毒時(shí)見發(fā)生[6]。本試驗(yàn)以大鼠的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型，證明了腸道細(xì)胞表面含有唾液酸受體，且SAa2,6Gal含量高于SAa2,3Gal 含量，提示腸道細(xì)胞可能更易感染人流感病毒。

微血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于循環(huán)血液與組織液之間的單層扁平上皮細(xì)胞，不但構(gòu)成微血管通透性的物理屏障，而且作為一種多功能分泌細(xì)胞，能夠合成和釋放多種細(xì)胞因子，通過多種途徑參與調(diào)解機(jī)體免疫反應(yīng)。微血管內(nèi)皮細(xì)胞意義重大，在維持血管壁的完整性、調(diào)節(jié)血管張力、血小板活化和聚集及血管壁重塑等方面具有重要作用[7]。微血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性被破壞，勢(shì)必會(huì)引起機(jī)體分泌功能失調(diào)，從而引發(fā)多種病理過程[8-9]。

有研究表明，高致病性禽流感病毒H5N1可通過腸道感染哺乳動(dòng)物，病毒通過血管系統(tǒng)的全身傳播導(dǎo)致的廣泛性出血與內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的大量感染有關(guān)[6]，這類似于禽類感染高致病性禽流感病毒的發(fā)病機(jī)制。而經(jīng)呼吸道感染引起的全身性疾病的發(fā)病機(jī)制則正相反，病灶主要以壞死和炎癥為特征，與實(shí)質(zhì)細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞中存在的流感病毒抗原有關(guān)。病毒從腸道進(jìn)入后明顯的內(nèi)皮趨向性提示高致病性H5N1流感病毒的表型具有高可塑性，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)性流感病毒感染的發(fā)病機(jī)制可能因侵染的入口不同而有差異。本試驗(yàn)結(jié)果也為流感病毒的內(nèi)皮細(xì)胞趨向性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。內(nèi)皮細(xì)胞在流感病毒感染中可能起著至關(guān)重要的作用，或存在重要的感染機(jī)制，本試驗(yàn)的結(jié)果可為深入探究流感病毒通過腸道屏障經(jīng)腸上皮細(xì)胞或通過血管系統(tǒng)經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞等不同途徑的傳播機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。