李 妍，李 敏，朱曉娟，陳浩宇，呂曉玲，張 穎，張 健

(1. 食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457；3. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

黃酒是我國(guó)特有的傳統(tǒng)酒種，與葡萄酒和啤酒并稱為世界三大古酒．黃酒是以谷物為原料，應(yīng)用霉菌、酵母和細(xì)菌等多種微生物共同作用釀造而成，富含低聚糖、有機(jī)酸、氨基酸、維生素、微量芳香成分和礦物質(zhì)等成分．黃酒營(yíng)養(yǎng)豐富，在我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)十分流行，深受消費(fèi)者喜愛[1–2]．

黃酒產(chǎn)品的風(fēng)格特點(diǎn)具有鮮明的地域性，比如：魯派黃酒以黍米為原料，酒液清亮透明，深棕紅色，酒香濃郁，口味醇厚，微苦而余香不絕；海派黃酒通過創(chuàng)新傳統(tǒng)黃酒的釀制工藝、配方，如添加枸杞、蜂蜜、姜汁，起到改變口感和增加營(yíng)養(yǎng)雙重目的；閩派黃酒采用紅曲、糯米，配以山泉精釀而成，具有清爽、低糖、原味、本色、營(yíng)養(yǎng)、綠色等特色；紹派黃酒以糯米為原料，采用鑒湖之水，按傳統(tǒng)工藝釀造，酒液橙黃清亮、醇厚甘甜、馥郁芬芳[3]．紹派黃酒是歷史最悠久、最有代表性的黃酒產(chǎn)品．2008年，紹興黃酒(紹興酒)成為我國(guó)第一個(gè)地理標(biāo)志(原產(chǎn)地)保護(hù)的黃酒產(chǎn)品．按照標(biāo)準(zhǔn) GB/T,17946—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品·紹興酒(紹興黃酒)》[4]規(guī)定，只有使用紹興的鑒湖水系并嚴(yán)格按照紹興酒質(zhì)量和工藝標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的黃酒，才能稱為“紹興黃酒”或“紹興酒”．隨著“地理標(biāo)志”概念的推廣與普及，相信在不久的將來會(huì)有更多的特色黃酒產(chǎn)品受到原產(chǎn)地保護(hù)．

為了使標(biāo)準(zhǔn)能夠貫徹實(shí)施，黃酒的“地理標(biāo)志”身份檢測(cè)至關(guān)重要．目前類似的檢測(cè)方法在葡萄酒、蜂蜜和中藥材中均有大量報(bào)道，但是對(duì)于黃酒產(chǎn)品，僅有寥寥幾篇采用電子舌、電子鼻或可見/近紅外光譜對(duì)黃酒進(jìn)行風(fēng)格、產(chǎn)地及酒齡的判別[5–7]．黃酒富含氨基酸，而氨基酸的種類和含量與原料和工藝息息相關(guān)．生物胺是由氨基酸脫羧而成，是黃酒中潛在的危害物質(zhì)．氨基酸和生物胺基本代表了黃酒中主要的含氮物質(zhì)，對(duì)這些成分的分析有可能找到不同產(chǎn)地黃酒中氮素的區(qū)別，從而對(duì)不同產(chǎn)地的黃酒進(jìn)行判別區(qū)分[8]．

為此，本實(shí)驗(yàn)以我國(guó)4個(gè)主要產(chǎn)地的黃酒為實(shí)驗(yàn)樣本，通過高效液相色譜(HPLC)技術(shù)對(duì)其中的游離氨基酸和生物胺進(jìn)行定性和定量分析．采用單因素方差分析 4個(gè)產(chǎn)區(qū)黃酒中的游離氨基酸和生物胺的差異，采用相關(guān)分析研究游離氨基酸和生物胺的相關(guān)性，最后采用多元統(tǒng)計(jì)方法分別建立基于游離氨基酸和生物胺水平的線性和非線性的產(chǎn)地判別模型，旨在為黃酒保真和原產(chǎn)地保護(hù)提供參考方法.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

48個(gè)市售黃酒樣品來源于 4個(gè)產(chǎn)地(產(chǎn)地影響力較大，地域特征較強(qiáng))，見表1．

1.2 試劑與儀器

衍生化試劑丹磺酰氯、2，4-二硝基氟苯、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺，色譜純，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(AAS18)、鳥氨酸、色氨酸，色譜純，Sigma公司；乙腈、甲酸，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、丙酮、鹽酸(37%)、氨水(27%)、氫氧化鈉、碳酸氫鈉，磷酸二氫鉀、乙酸鈉，分析純，天津市江天化工技術(shù)有限責(zé)任公司．

表1 黃酒樣品的產(chǎn)地和數(shù)量Tab. 1 The origin and amount of rice wine samples

LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津科技有限公司；ODS-C18色譜柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Thermo有限公司；渦旋振蕩儀，德國(guó) Wiggens公司；超純水機(jī)，密理博中國(guó)有限公司；水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司；CNW MCX固相萃取柱，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生物胺的測(cè)定方法

衍生化處理：吸取 1,mL生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、1,mL衍生劑(丹磺酰氯溶液)、1,mL飽和碳酸氫鈉溶液于 10,mL離心管中，輕輕振蕩混勻，置于 60,℃恒溫水浴鍋中反應(yīng) 30,min；衍生完成后取出冷卻，向離心管中加入100,μL氨水，再次置于60,℃水浴鍋中反應(yīng) 15,min，樣液備用．將 CNW MCX固相萃取柱與Visiprep型固相萃取裝置相連，用甲醇和超純水洗柱后，將樣液與 5%,的甲酸混合后上柱，流速為 1～2滴/秒；待超純水淋洗萃取柱后，用含 5%,氨水的甲醇洗脫，收集洗脫后經(jīng)0.22,μm有機(jī)膜過濾，待進(jìn)樣．

色譜條件：色譜柱為 Phenomenon ODS-C18柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)配以 C18 保護(hù)柱(4.0,mm×3.0,mm，5,μm)，采用二元梯度分析，流動(dòng)相 A 為超純水，流動(dòng)相 B 為 100%,乙腈，柱溫 30,℃，進(jìn)樣量20,μL，流量 1,mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254,nm．

1.3.2 氨基酸測(cè)定方法

衍生化處理：取100,μL衍生緩沖溶液(碳酸氫鈉溶液)于10,mL EP管中，加入10,μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品和50,μL衍生劑，最后加入740,μL緩沖溶液(磷酸二氫鉀溶液)，避光65,℃水浴1,h．經(jīng)0.22,μm有機(jī)膜過濾后，待進(jìn)樣．

色譜條件：色譜柱為 Phenomenon ODS-C18柱(250,mm×4.6,mm，5,μm)配以C18 保護(hù)柱(4.0,mm×3.0,mm，5,μm)，采用二元梯度分析，流動(dòng)相 A 為乙酸鈉溶液，流動(dòng)相 B為乙腈/超純水(體積比為 1∶1)，柱溫 33,℃，進(jìn)樣量 20,μL，流量 1,mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360,nm．

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的單因素方差分析(ANOVA)、相關(guān)性分析(CA)、主成分分析(PCA)、判別分析(DA)研究由 SPSS 17.0 實(shí)現(xiàn)(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)；由 MATLAB 7.14(Release 2012a，Mathworks，USA)進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)分析．*表示 P＜0.05為顯著性差異，**表示 P＜0.01為極顯著性差異，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺含量分析

2.1.1 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的液相色譜分析

標(biāo)準(zhǔn)品及樣品高效液相色譜圖如圖 1所示．從圖 1可以看出，各色譜峰間分離度良好，峰形尖銳，無(wú)拖尾現(xiàn)象，可以滿足常規(guī)的定性與定量分析．

圖1 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品及樣品高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC of the biogenic amine standards and the samples

2.1.2 生物胺含量概況

48個(gè)黃酒樣品中檢測(cè)出了 6種生物胺，色胺在所有樣品中均未檢出．浙江產(chǎn)地的黃酒中生物胺含量最高，其次為上海(表2)．

表2 生物胺的方差分析結(jié)果Tab. 2 ANOVA results of biogenic amines

2.2 氨基酸含量分析

2.2.1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的液相色譜分析

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品與樣品高效液相色譜圖見圖 2．由圖 2可以看出，各色譜峰間分離度良好，峰形尖銳，可以滿足常規(guī)的定性與定量分析．

2.2.2 游離氨基酸含量概況

48個(gè)黃酒樣品中檢測(cè)出了18種氨基酸，氯化銨和色氨酸在所有樣品中均未檢出．浙江黃酒中氨基酸含量最高，其次為上海(表3)．

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 單因素方差分析

浙江、上海、山東和湖北產(chǎn)地的 48個(gè)黃酒樣品中，可檢出游離氨基酸及生物胺含量的單因素方差分析結(jié)果見表2和表3．結(jié)果表明，在95%,的顯著水平上，黃酒樣品中除甘氨酸、β-苯乙胺和尸胺外，其他21個(gè)變量在產(chǎn)地間均存在顯著差異．這可能與不同產(chǎn)區(qū)黃酒所用的原、輔料和工藝不同有關(guān)，呈現(xiàn)出很強(qiáng)的地域差別．總體而言，浙江產(chǎn)地黃酒中游離氨基酸(除甘氨酸)含量要明顯高于其他 3個(gè)產(chǎn)地．相應(yīng)的，浙江產(chǎn)地黃酒中生物胺(除亞精胺)含量也明顯高于其他3個(gè)產(chǎn)地．

圖2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品與樣品高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC of the amino acids standards and the samples

表3 游離氨基酸的方差分析結(jié)果Tab. 3 ANOVA results of free amino acids

2.3.2 相關(guān)性分析

使用 Pearson’s積差相關(guān)度對(duì)用于產(chǎn)地鑒別的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，表 4列出了顯著相關(guān)的60對(duì)變量，其中47對(duì)變量極顯著相關(guān)．由此表可以看出，腐胺、組胺、酪胺與大多數(shù)氨基酸之間密切正相關(guān)，而亞精胺與氨基酸之間呈負(fù)相關(guān)．由表 2—表 4可知：氨基酸含量越高，則生物胺含量也越高，浙江產(chǎn)區(qū)黃酒樣品中氨基酸含量豐富，所以生物胺含量也相對(duì)較高，上海次之；對(duì)于亞精胺而言，氨基酸含量越高，亞精胺含量越低，結(jié)果顯示浙江產(chǎn)區(qū)黃酒中亞精胺含量較其他3個(gè)產(chǎn)地的更低．

表4 變量間的Pearson’s顯著相關(guān)Tab. 4 Significant Pearson’s correlations between variables

2.3.3 逐步判別分析

判別分析中指標(biāo)較多時(shí)，一些不重要變量的引入會(huì)產(chǎn)生干擾而影響判別效果，甚至一些變量的引入可能引起計(jì)算上的困難．因此，變量的選擇是判別分析中重要的問題，逐步判別分析就是解決合理選擇變量進(jìn)行判別分析的一種方法．采用逐步判別的分析方法，從具有顯著差別的 21個(gè)變量中選出了 9個(gè)具有較強(qiáng)判別能力的變量：絲氨酸、賴氨酸、酪氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、胱氨酸、組氨酸和組胺，進(jìn)行 Fisher判別分析(典則判別分析)．得到 3個(gè)典則判別方程(函數(shù) 1、函數(shù) 2和函數(shù) 3)，各變量的系數(shù)見表5．

表5 產(chǎn)地鑒別典則判別方程系數(shù)Tab. 5 Canonical discrimination function coefficients of origin identification

本研究所用的逐步判別方法為Milks Lambra．其判據(jù)是：進(jìn)入模型的F值為3.84；從模型中剔除變量的F值為2.71．生物胺變量中只有組胺進(jìn)入了模型，可見在黃酒產(chǎn)地判別中，氨基酸更為重要．圖 3是 3個(gè)典則判別方程的三維得分圖，在圖中可清楚地看到48個(gè)樣品分布到 4個(gè)區(qū)域中，明顯可以分開．但是，對(duì)浙江產(chǎn)區(qū)內(nèi)的地理標(biāo)志紹興酒和紹興產(chǎn)其他黃酒及省內(nèi)其他黃酒樣品，三維得分圖卻無(wú)法分開．

圖3 黃酒樣本的判別方程三維得分圖Fig. 3 3D scores of rice wine samples

用所建立的模型進(jìn)行回代檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證(隨機(jī)從一組測(cè)定數(shù)據(jù)中抽取一部分?jǐn)?shù)據(jù)來建立模型，用其余的數(shù)據(jù)檢驗(yàn)此模型的驗(yàn)證方法)，最終的 Bayes判別結(jié)果見表 6．回代檢驗(yàn)結(jié)果表明，整體的判別正確率為 100%．交叉驗(yàn)證中有 2個(gè)樣品的產(chǎn)地被判錯(cuò)，整體判別正確率為 96%，誤判率較低．浙江產(chǎn)區(qū)中有1個(gè)樣品被誤判為上海的產(chǎn)品，但該樣品卻是地理標(biāo)志紹興酒，可見采用逐步判別方法選擇氨基酸和生物胺對(duì)黃酒產(chǎn)地進(jìn)行判別是可行的；但該方法無(wú)法對(duì)同屬浙江省的地理標(biāo)志紹興酒和紹興產(chǎn)其他黃酒及省內(nèi)其他黃酒樣品的進(jìn)行判別．

表6 產(chǎn)地鑒別的Bayes判別結(jié)果Tab. 6 Bayes discrimination results of origin identification

地理標(biāo)志紹興酒的認(rèn)證必須具備3個(gè)條件：一是企業(yè)所屬地域必須在紹興鑒湖水系特定的地域范圍內(nèi)；二是必須采用優(yōu)質(zhì)糯米、小麥、鑒湖水作為釀酒原料，經(jīng)獨(dú)特工藝發(fā)酵釀造而成，產(chǎn)品質(zhì)量必須符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T,17946—2008[4]；三是企業(yè)必須具有一定的人文歷史．由此可見，難于判別地理標(biāo)志紹興酒和紹興產(chǎn)其他黃酒及浙江省內(nèi)其他黃酒樣品是很正常和容易理解的．

黃酒中的氨基酸和生物胺受到原輔料、微生物、水質(zhì)和釀造工藝等多種因素的影響，其差異間接反映了這些因素的不同．上海、山東、湖北產(chǎn)區(qū)的釀造用水均非鑒湖水，湖北產(chǎn)區(qū)的很多黃酒采用小曲糖化發(fā)酵，山東產(chǎn)區(qū)的很多黃酒采用黍米釀造．另外，釀造工藝上各產(chǎn)區(qū)也有自身的特點(diǎn)，有用傳統(tǒng)攤飯發(fā)酵，也有喂飯發(fā)酵；有大缸發(fā)酵人工開耙，也有大罐發(fā)酵自動(dòng)開耙．總之，這些因素差別越大，以氨基酸和生物胺為參數(shù)分類酒樣就越容易．

2.3.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種模仿動(dòng)物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)行為特征，進(jìn)行分布式并行信息處理的算法數(shù)學(xué)模型．這種網(wǎng)絡(luò)依靠系統(tǒng)的復(fù)雜程度，通過調(diào)整內(nèi)部大量節(jié)點(diǎn)之間相互連接的關(guān)系，從而達(dá)到處理信息的目的，并具有自學(xué)習(xí)和自適應(yīng)的能力[9]．BP網(wǎng)絡(luò)(back propagation)是目前應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型之一．BP網(wǎng)絡(luò)能學(xué)習(xí)和存貯大量輸入-輸出模式的映射關(guān)系，它具有實(shí)現(xiàn)任何復(fù)雜非線性映射的功能，能以任意精度逼近任何非線性連續(xù)函數(shù)．在建模過程中的許多問題正是具有高度的非線性，這使得它特別適合于求解內(nèi)部機(jī)制復(fù)雜的問題[10]．

(1)隱含層神經(jīng)元數(shù)的確定

隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)對(duì) BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)影響較大，若隱含層神經(jīng)元的個(gè)數(shù)較少，則不能充分描述輸出和輸入變量之間的關(guān)系；相反，若隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)較多，則會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)時(shí)間變長(zhǎng)，甚至?xí)霈F(xiàn)過擬合的問題．一般根據(jù)參考公式n =，其中 n代表隱含層神經(jīng)元數(shù)，a代表輸入向量維數(shù)，b代表輸出向量維數(shù)，c代表 1～10的正整數(shù)，可推出隱含層單元數(shù)的選取范圍．根據(jù)上述公式可得出最佳隱含層神經(jīng)元數(shù)在 5～15之間，依次從最小神經(jīng)元數(shù)至最大神經(jīng)元數(shù)訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)(此時(shí)學(xué)習(xí)率為 0.01)，結(jié)果見表 7.由表7可知神經(jīng)元數(shù)為7時(shí)決定系數(shù)R2相對(duì)較?。?/p>

表7 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元個(gè)數(shù)的選取Tab. 7 Selection of neuron number in BP artificial neural network

(2)學(xué)習(xí)率的確定

學(xué)習(xí)率的確定大多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值進(jìn)行多次嘗試，本實(shí)驗(yàn)分別取 0.01、0.03、0.05，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試．推測(cè)在隱含層神經(jīng)元數(shù)取 7時(shí)，網(wǎng)絡(luò)性能得到極大地改善．由表 8可知，學(xué)習(xí)率越大，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練次數(shù)越少，實(shí)際誤差變化較小．本實(shí)驗(yàn)中擬選學(xué)習(xí)率為0.05．

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值與真實(shí)值對(duì)比如圖 4所示．從圖 4中可以清晰地看到，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能較好地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)地的預(yù)測(cè)，模型擬合度良好，結(jié)果正確率100%，相對(duì)誤差低于 0.2%．人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有自學(xué)習(xí)功能和聯(lián)想存儲(chǔ)功能，在尋找一個(gè)復(fù)雜問題的優(yōu)化解時(shí)，往往需要很大的計(jì)算量，利用一個(gè)針對(duì)某問題而設(shè)計(jì)的反饋型人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮計(jì)算機(jī)的高速運(yùn)算能力，能很快找到優(yōu)化解．相比逐步判別分析，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模預(yù)測(cè)更準(zhǔn)確；但顯然，該方法也無(wú)法對(duì)同屬浙江省的地理標(biāo)志紹興酒和紹興產(chǎn)其他黃酒及省內(nèi)其他黃酒樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)．

表8 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)率的選擇Tab. 8 Selection of learning rate in BP artificial neural network

圖4 預(yù)測(cè)值與真實(shí)值對(duì)比Fig. 4 Contrast of predicted and real values

3 結(jié) 論

所有黃酒樣品中均未檢出色胺、氯化銨和色氨酸．不同產(chǎn)地的黃酒中，除甘氨酸、β-苯乙胺和尸胺外，其他 6種生物胺和 15種氨基酸均存在顯著差異．腐胺、組胺、酪胺與大多數(shù)氨基酸之間呈正相關(guān)，而亞精胺與氨基酸之間呈負(fù)相關(guān)．基于氨基酸和生物胺的含量的逐步判別方程和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型均能實(shí)現(xiàn)黃酒產(chǎn)地的判別與預(yù)測(cè)，但是這兩種方法均無(wú)法對(duì)同屬浙江省的地理標(biāo)志紹興酒和紹興產(chǎn)其他黃酒及省內(nèi)其他黃酒樣品進(jìn)行判別．

建立地理標(biāo)志紹興酒的檢測(cè)方法對(duì)原產(chǎn)地保護(hù)具有重要意義，但難度很大，尤其是對(duì)于浙江省內(nèi)采用鑒湖水系的釀造黃酒的地域，因?yàn)檫@些地域內(nèi)很多酒廠的工藝相似、風(fēng)土相近，地理標(biāo)志紹興酒與非地理標(biāo)志酒的區(qū)別也許并非黃酒本身，而在于是否認(rèn)證．以不同產(chǎn)區(qū)(省)為單位來分類判別黃酒可能更為實(shí)際，這也是黃酒原產(chǎn)地保護(hù)的趨勢(shì)．