錢小英,林海鋒,周安喜,卓曼云
乳腺癌患者數(shù)量在全球范圍內(nèi)呈不斷上升趨勢,已成為臨床重大難題之一[1],其多發(fā)生于乳腺上皮組織,是一類惡性腫瘤。近年來,輔助診斷乳腺癌的啟動子甲基化逐漸成為生物化學及醫(yī)學界的研究重點和熱點[2]。研究表明,多個癌基因及CpG位點的聯(lián)合檢測比單個癌基因更有利于診斷乳腺癌和揭示乳腺癌的臨床分型和分子病理機制[3]。同時許多維持機體正?;顒拥腄NA可能因乳腺癌啟動子區(qū)CpG位點的甲基化而喪失其功能[4]。為加深對乳腺癌演變機制的認識,本研究將重點針對乳腺癌組織中胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)、乳腺癌易感基因1(BRCA1)/O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)基因甲基化情況及其與臨床病理特征的關系進行分析,以期為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及臨床診治提供參考依據(jù)。
1.1 納入與排除標準 納入標準:(1)>18歲女性;(2)組織標本經(jīng)過病理學檢測后確診為乳腺癌;(3)行乳腺癌切除術前接受放射治療、化學藥物治療等;(4)知情同意并自愿參與本研究。排除標準:(1)伴有嚴重心、肝、腎功能不全或合并有其他高危疾?。唬?)有神經(jīng)系統(tǒng)疾病史、精神疾病史以及近期服用精神疾病藥物;(3)有凝血功能障礙或其他手術禁忌證;(4)臨床資料不全。
1.2 研究對象 選取2015年1月—2016年6月海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院收治的符合納入標準的乳腺癌患者100例為研究對象,年齡為24~75歲,平均年齡(43.6±9.8)歲。本研究獲得本院倫理委員會批準。
1.3 研究方法 乳腺癌切除術中取患者乳腺癌組織及其邊緣5 cm處癌旁組織,分析患者乳腺癌組織臨床病理特征,并立即放入溫度為-196 ℃的液氮速凍箱中保存。
1.3.1 DNA的提取及亞硫酸處理 通過組織DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)對患者乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因DNA進行提取,然后通過EZ DNA甲基化試劑盒-Gold(北京中西遠大科技有限公司,型號BTT3-D5024)對200~500 ng DNA進行亞硫酸處理。試驗操作均按照試劑盒說明書進行規(guī)范操作,操作過程保證無污染。
1.3.2 甲基化特異性聚合酶鏈式反應(PCR)和電泳分析 加入1.5 μl經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA模板、1.5 μl 10×緩沖液(含Mg2+)、0.12 μl Hotstar Taq DNA聚合酶、0.15 μl 20 nmol/L的下游引物、0.15 μl 20 nmol/L的上游引物、0.45 μl 20 mmol/L的dNTPs,混合調(diào)整后體積為15 μl,進行反應。反應結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物5 μl進行凝膠電泳。以經(jīng)過甲基化處理的DNA作為陽性對照,以未經(jīng)過甲基化處理的外周血淋巴細胞DNA(全基因組擴增)作為陰性對照。GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特異性PCR擴增基因的引物序列見表1。
表1 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特異性PCR所用引物序列及反應條件Table 1 The primer sequence and reaction conditions of methylationspecific PCR analysis of GSTP1,BRCA1 and MGMT genes
1.4 隨訪 自患者手術日起開始隨訪,截止時間為2017年11月,每3個月進行電話隨訪,終點事件為死亡或失訪。記錄患者的生存情況、疾病進展情況(局部復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移、陽性淋巴結(jié)等)。
1.5 統(tǒng)計學方法 通過SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗;計量資料以(±s)表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;采用Cox回歸分析分析GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化狀態(tài)與乳腺癌患者預后的關系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 乳腺癌組織及其邊緣5 cm處癌旁組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化情況 乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化特異性PCR的代表性結(jié)果見圖1。在100例乳腺癌組織中,GSTP1基因甲基化的發(fā)生率為31.0%(31/100),BRCA1基因甲基化的發(fā)生率為26.0%(26/100),MGMT基因甲基化的發(fā)生率為20.0%(20/100);在乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織中,GSTP1基因甲基化的發(fā)生率為12.0%(12/100),BRCA1基因甲基化的發(fā)生率為8.0%(8/100),MGMT基因甲基化的發(fā)生率為4.0%(4/100)。乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的發(fā)生率低于乳腺癌組織,差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=11.481、12.121、10.695,P值均<0.001)。
在100例乳腺癌組織中,GSTP1、BRCA1、MGMT基因中至少1個基因發(fā)生甲基化54例(54.0%),其中3個基因均發(fā)生甲基化5例(9.3%)、任意2個基因發(fā)生甲基化18例(33.3%)、僅有1個基因發(fā)生甲基化31例(57.4%)。在100例乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織中,GSTP1、BRCA1和MGMT基因中至少1個基因發(fā)生甲基化21例(21.0%),其中3個基因均發(fā)生甲基化0例、任意2個基因發(fā)生甲基化5例(23.8%)、僅有1個基因發(fā)生甲基化16例(76.2%)。每例患者乳腺癌組織甲基化基因數(shù)為(0.74±0.09),低于乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織甲基化基因數(shù)(0.25±0.03),差異有統(tǒng)計學意義(t=51.650,P<0.001)。
圖1 3種基因在乳腺癌組織中甲基化特異性PCR代表性結(jié)果Figure 1 Representative results of PCR analysis of the methylation status of 3 genes in breast cancer tissues
2.2 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化與乳腺癌臨床病理特征的關系 不同腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況乳腺癌組織中甲基化基因數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同病理類型、人表皮生長因子受體2(HER-2)狀態(tài)、孕激素受體狀態(tài)乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性率比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);癌組織直徑≥20 mm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中GSTP1基因甲基化陽性率高于癌組織直徑<20 mm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);年齡<50歲、雌激素受體陰性乳腺癌組織BRCA1基因甲基化陽性率高于年齡≥50歲、雌激素受體陽性乳腺癌組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);組織學Ⅲ級、乳腺癌Ⅱ~Ⅳ期、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移乳腺癌組織MGMT基因甲基化陽性率高于組織學Ⅰ~Ⅱ級、乳腺癌Ⅰ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。
2.3 預后情況 100例患者中,治愈73例,疾病進展27例,無死亡病例發(fā)生。
2.4 乳腺癌患者預后影響因素的Cox回歸分析 以預后為因變量(賦值:治愈=0,疾病進展=1),以GSTP1基因甲基化陽性(賦值:是=0,否=1)、BRCA1基因甲基化陽性(賦值:是=0,否=1)、MGMT基因甲基化陽性(賦值:是=0,否=1)為自變量,進行Cox回歸分析,結(jié)果顯示,GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性是乳腺癌患者預后的影響因素(P<0.05,見表3)。
表3 乳腺癌患者預后影響因素的Cox回歸分析Table 3 Cox regression analysis of the prognostic factors in patients with breast cancer
乳腺癌發(fā)生進展的整個過程中,抑癌基因的失活和原癌基因的激活起著關鍵作用,同時也有其他多個基因表達參與[5-7]。目前認為,基因啟動子區(qū)的CpG位點的異常甲基化是乳腺癌發(fā)展過程中抑癌基因失活的主要原因[8]。因此CpG位點的異常甲基化逐漸成為乳腺癌臨床研究的熱點。但既往研究主要為單基因分析,故而研究結(jié)果不一致。目前已知一些重要基因會因啟動子區(qū)的CpG位點的異常甲基化而失去其原有功能從而導致細胞癌變,如介導激素和受體、轉(zhuǎn)導細胞信號、調(diào)控細胞周期、執(zhí)行DNA修復和細胞黏附等功能基因[9]。既往報道指出,基因異常甲基化的研究有利于診斷、治療乳腺癌及其病因探討[10]。因此進一步探討乳腺癌相關基因與其演變過程及惡性特征的關系,可以幫助臨床及早診斷、治療乳腺癌。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的發(fā)生率分別為31.0%、26.0%、20.0%。乳腺癌組織中GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化的發(fā)生率高于乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織。有54.0%乳腺癌組織至少有1個基因發(fā)生甲基化。每例患者乳腺癌組織甲基化基因數(shù)高于乳腺癌組織邊緣5 cm處癌旁組織。
表2 GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化與乳腺癌臨床病理特征的關系〔n(%)〕Table 2 Relationship of the methylation status in the promoter regions of GSTP1,BRCA1 and MGMT genes with the pathological features of breast cancer
研究顯示,GSTP1、BRCA1、MGMT基因的功能均是執(zhí)行DNA修復[11]。本研究通過聯(lián)合分析GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化發(fā)現(xiàn),不同腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況乳腺癌組織中甲基化基因數(shù)比較有差異。吳亮等[12]的研究亦指出,94.3%的乳腺癌患者至少有1個基因發(fā)生甲基化,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者BRCA1基因甲基化陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,本研究結(jié)果與其相似。年齡<50歲、雌激素受體陰性乳腺癌組織BRCA1基因甲基化陽性率高于年齡≥50歲、雌激素受體陽性乳腺癌組織,提示BRCA1基因甲基化與雌激素通路可能存在一定的相互作用關系。
本研究結(jié)果顯示不同病理類型、HER-2狀態(tài)、孕激素受體狀態(tài)乳腺癌組織的GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性率比較有差異。GSTP1通過參與機體代謝消除人體內(nèi)的有毒物質(zhì)從而發(fā)揮解毒、抗DNA損傷和抑制細胞癌變的作用[13]。而GSTP1基因啟動子區(qū)異常甲基化會使其無法表達,因此當該基因發(fā)生甲基化時提示該乳腺癌患者預后不良[14]。現(xiàn)代分子生物學研究表明,MGMT基因的正常表達能夠修復細胞的烷化損害,維持DNA的穩(wěn)定[15]。當該基因表達沉默時,機體DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中會發(fā)生各種錯誤并不斷積累直至基因紊亂、崩潰,使得原癌基因及其相關基因活化,產(chǎn)生癌細胞并迅速增殖[16-17]。因此當MGMT基因發(fā)生甲基化而無法表達時,乳腺癌患者的疾病會迅速惡化,在乳腺癌分期上表現(xiàn)為較晚分期,提示其能夠影響乳腺癌的進展與演變[18]。本研究結(jié)果也表明組織學Ⅲ級、乳腺癌Ⅱ~Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織MGMT基因甲基化陽性率高于組織學Ⅰ~Ⅱ級、乳腺癌Ⅰ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織。進一步分析發(fā)現(xiàn),GSTP1、BRCA1、MGMT基因甲基化陽性是乳腺癌患者預后的影響因素。因此,GSTP1、BRCA1、MGMT基因發(fā)生異常甲基化時對評估乳腺癌患者預后有一定臨床價值。但本研究隨訪時間較短,未觀察到患者總生存期和無病生存期。在以后的研究中,可擴大樣本量并延長隨訪時間以進一步驗證。
綜上所述,GSTP1、BRCA1、MGMT基因能幫助修復DNA,發(fā)生甲基化基因數(shù)高于癌旁組織,且其發(fā)生異常甲基化時影響乳腺癌病情進展。因此對其進行聯(lián)合檢測甲基化有利于臨床診斷、治療乳腺癌并預測其預后。
作者貢獻:錢小英進行試驗設計與實施、資料收集與整理,撰寫論文并對文章負責;周安喜、卓曼云進行試驗實施、評估、資料收集;林海鋒進行質(zhì)量控制及審校。
本文無利益沖突。