樊霞，安冬，李琰，康山*

子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科常見疾病，5%～10%的育齡期婦女患有此病，且30%～50%伴有不孕［1］。目前該病的病因尚不十分清楚。子宮內(nèi)膜異位癥雖然為良性病變，但具有類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為，有活性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、侵襲、黏附、生長(zhǎng)，形成異位病灶。積累的證據(jù)顯示與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)的基因在子宮內(nèi)膜異位癥的形成中也起著重要作用［2-4］。

腫瘤抑制基因——E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、去分化、侵襲和轉(zhuǎn)移均有密切關(guān)系。關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的研究也證明E-cadherin缺失的子宮內(nèi)膜細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力［5］，且患者的在位、異位內(nèi)膜可能存在著E-cadherin的異常表達(dá)［6］。

基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，參與基因的表達(dá)調(diào)控。前期有研究證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中E-鈣黏蛋白基因（CDH1）啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)水平下調(diào)的重要原因［7-8］。本研究擬探討卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，目的在于探討CDH1表觀遺傳學(xué)改變與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究納入50例卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者和50例由于宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅲ級(jí)行子宮切除或子宮探查的患者（對(duì)照婦女）。均來自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，納入時(shí)間為2011年10月—2013年8月。卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者經(jīng)腹腔鏡手術(shù)確診，均為Ⅲ～Ⅳ期［9］，年齡22～51歲，平均年齡（36.7±6.8）歲。對(duì)照婦女年齡26～55歲，平均年齡（38.5±3.8）歲。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除合并子宮內(nèi)膜病變、子宮肌瘤、內(nèi)分泌疾病及術(shù)后病理證實(shí)合并其他卵巢良惡性腫瘤的患者。

1.3 標(biāo)本采集 術(shù)中無菌采集卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜（在位內(nèi)膜組）、異位內(nèi)膜（異位內(nèi)膜組）及對(duì)照婦女子宮內(nèi)膜組織（對(duì)照子宮內(nèi)膜組），放入RNAlater溶液（Carlsbad，美國(guó)）中，-20 ℃保存。

1.4 DNA提取與甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（MSP）

在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組和對(duì)照子宮內(nèi)膜組DNA采用Wizard?基因組DNA提取試劑盒（Promega，美國(guó)）提取。采用NanoDrop 1000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）檢測(cè)所提取DNA的濃度。1 μg DNA采用BisulFlashTM DNA修飾試劑盒（Epigentek，美國(guó)）進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。修飾后的DNA使用MSP方法檢測(cè)CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。甲基化引物（M）：5'-GGTGTTTTAGTTAATTAGCCGGTAC-3'（上游）和5'-CATAACTAACCGA AAACGCCG-3'（下游）；非甲基化引物（U）：5'-GGTAGGTGAATTTTTA GTTAATTAGTGGTA-3'（ 上 游） 和5'-CCCATAACTAACCAAAAACACCA-3'（下游）（北京賽百盛生物工程有限責(zé)任公司，中國(guó)）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：甲基化為204 bp，非甲基化為211 bp。以甲基轉(zhuǎn)移酶處理的正常人外周血DNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為甲基化陽性對(duì)照標(biāo)本（甲基化陽性組），正常人外周血DNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為甲基化陰性對(duì)照標(biāo)本（甲基化陰性組），PCR時(shí)用水代替模板DNA所得的PCR產(chǎn)物為空白對(duì)照（見圖1）。

本文創(chuàng)新點(diǎn)：

本研究首次在人體組織中探討了E-鈣黏蛋白基因（CDH1）啟動(dòng)子區(qū)甲基化與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系。結(jié)果提示子宮內(nèi)膜組織CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化所致的E-鈣黏蛋白異常表達(dá)可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生中起重要作用。

圖1 CDH1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)Figure 1 Methylation status of the CDH1 promoter

1.5 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）在位內(nèi)膜組、異位內(nèi)膜組和對(duì)照子宮內(nèi)膜組CDH1 RNA采用Trizol試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）提取。cDNA合成采用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒。RT-PCR引物：（1）E-cadherin（314 bp）：5'-AGTGCCAACTGGACCATTCA-3'（上游）和5'-TCTTTGACCACCGCTCTCCT-3'（下游）；（2）GAPDH（452 bp）：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'（上游）和5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（下游）。PCR產(chǎn)物采用4%瓊脂糖膠檢測(cè)（見圖2）。

圖2 RT-PCR檢測(cè)內(nèi)膜組織CDH1 mRNA表達(dá)Figure 2 Expression of CDH1 mRNA detected by PT-PCR

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析E-cadherin表達(dá)水平 將甲基化陽性組和甲基化陰性組子宮內(nèi)膜組織制備成單細(xì)胞懸液，冷PBS沖洗2次后，將細(xì)胞懸浮在1 ml含有E-cadherin-FITC或isotype-FITC 抗體的PBS中，室溫避光30 min，PBS沖洗后重新懸浮在1 ml PBS中。采用FC500（Beckman Coulter，美國(guó)）流式細(xì)胞儀檢測(cè)E-cadherin表達(dá)水平（見圖3）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)膜組織E-cadherin表達(dá)水平Figure 3 Expression of E-cadherin protein detected by flow cytometry

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài) 在位內(nèi)膜組CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率為26.0%（13/50），異位內(nèi)膜組為32.0%（16/50），對(duì)照子宮內(nèi)膜組為8.0%（4/50）。3組CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.09，P=0.011）；其中在位內(nèi)膜組和異位內(nèi)膜組CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率高于對(duì)照子宮內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.74，P=0.017；χ2=9.00，P=0.003）；在位內(nèi)膜組和異位內(nèi)膜組CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.44，P=0.509）。

2.2 CDH1 mRNA表達(dá)水平比較 甲基化陽性組CDH1 mRNA的表達(dá)水平低于甲基化陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 E-cadherin表達(dá)水平比較 甲基化陽性組E-cadherin的表達(dá)水平低于甲基化陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 甲基化陽性、陰性組CDH1 mRNA、E-cadherin表達(dá)水平Table 1 Expression of CDH1 mRNA and E-cadherin in methylationpositive and methylation-negative groups

2.4 CDH1 mRNA表達(dá)水平和E-cadherin表達(dá)水平的相關(guān)性 CDH1 mRNA表達(dá)水平和E-cadherin表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.43，P=0.017）。

3 討論

3.1 CDH1異常甲基化與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥E-cadherin是一種鈣依賴性黏附分子，分布于各類上皮細(xì)胞，主要介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，維持細(xì)胞極性和參與分化調(diào)節(jié)，對(duì)維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)和完整性起重要作用。其編碼基因CDH1被公認(rèn)是腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的抑制基因。上皮細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平降低可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。通過EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性、與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。因此，E-cadherin表達(dá)丟失在腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲中起重要作用。子宮內(nèi)膜異位癥患者的內(nèi)膜細(xì)胞也存在著E-cadherin的異常表達(dá)。一些研究顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜腺上皮的E-cadherin表達(dá)水平明顯降低［10］，相反地，有研究發(fā)現(xiàn)患者的E-cadherin表達(dá)水平明顯高于對(duì)照婦女［11］。但體外研究顯示E-cadherin表達(dá)陰性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移侵襲能力，E-cadherin表達(dá)陽性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞則不具有轉(zhuǎn)移侵襲能力［5］。因此E-cadherin表達(dá)丟失與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)。

E-cadherin表達(dá)丟失的機(jī)制尚不明確，啟動(dòng)子區(qū)的甲基化是基因失活的主要機(jī)制之一。前期的研究發(fā)現(xiàn)多種上皮性腫瘤組織中存在CDH1啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化，且異常甲基化所導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)失活與腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)［12-14］。然而，有關(guān)子宮內(nèi)膜異位癥中CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀態(tài)及與E-cadherin表達(dá)關(guān)系的研究還十分有限。WU等［15］證實(shí)在2個(gè)永生化的子宮內(nèi)膜異位癥的細(xì)胞系中，CDH1啟動(dòng)子區(qū)為高甲基化狀態(tài)，細(xì)胞具有明顯的轉(zhuǎn)移侵襲能力；采用組蛋白脫乙酰酶抑制劑A處理細(xì)胞重新活化E-cadherin表達(dá)，細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯降低。提示至少在子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞系中，CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化導(dǎo)致的E-cadherin表達(dá)陰性可能與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在位、異位內(nèi)膜組CDH1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化陽性率明顯高于對(duì)照子宮內(nèi)膜組，表明卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者中存在著CDH1的異常甲基化。

3.2 CDH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與其在子宮內(nèi)膜組織表達(dá)的關(guān)系 DNA甲基化是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要方式之一，DNA甲基化可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因的表達(dá)，且甲基化水平與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究采用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了CDH1啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)膜組織CDH1 mRNA、E-cadherin的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)甲基化陽性組的CDH1 mRNA、E-cadherin的表達(dá)水平明顯低于甲基化陰性組?；贓-cadherin在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中的作用，推測(cè)子宮內(nèi)膜組織CDH1啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化所導(dǎo)致的E-cadherin表達(dá)異?？赡苁锹殉沧訉m內(nèi)膜異位癥發(fā)生的重要原因。

本研究結(jié)果可能為探討卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生機(jī)制提供重要的理論依據(jù)，也可能為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的臨床治療提供新的思路。

作者貢獻(xiàn)：樊霞、安冬、李琰、康山進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究的實(shí)施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集與整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果的分析與解釋、論文的撰寫、中/英文修訂；康山負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。