□ 鄭亞玲 新疆水產(chǎn)科學(xué)研究所（新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心）

多糖廣泛存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中，是一類天然高分子化合物，其在抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗?jié)?、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等方面有良好的應(yīng)用前景[1]。

凝膠色譜[2]又稱分子篩色譜，凝膠柱色譜法常用的凝膠有葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，可使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離[3]。多糖是極性大分子化合物，具有分子量、組成、聚合度、分子形狀不均一的特點[4]。測定多糖純度的方法有功能團分析、比旋光度、水解后糖組分分析、紙色譜、紫外-可見吸收光譜法和高效液相色譜、超離心和高壓電泳、超離心分析法等[2]。

1 檢測方法

1.1 紙色譜法

紙色譜法[5]是以濾紙作為載體，讓樣品溶液在濾紙上展開。紙色譜的溶劑由有機溶劑和水組成，當(dāng)有機溶劑和水部分溶解時則有兩種可能——一相是以水飽和的有機溶劑相，一相是以有機溶劑飽和的水相。紙色譜中的流動相是指層析液在毛細拉力作用下能不斷由下向上流動，固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具有親水性，故使這部分水束縛在纖維素周圍，不易擴散而成為固定相。在層析過程中，當(dāng)層析液在毛細拉力作用下上升，流經(jīng)色素濾液細線時，濾液細線上的色素就相繼溶入層析液，隨著層析液上升發(fā)生再分配，即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系數(shù)不同，那些分配系數(shù)大的色素分子隨層析液向上移動得快，形成的色素帶集中在濾紙上部；而分配系數(shù)小的色素分子，隨層析向上移動得慢，形成的色素帶集中在濾紙下面。

1.2 紫外-可見吸收光譜法

一種純物質(zhì)在一定條件、一定波長范圍內(nèi)，它的吸收光譜是一定的。根據(jù)物質(zhì)吸收光譜最大吸收峰波長的位置或吸收峰形狀和數(shù)量，可以判斷該物質(zhì)的純度。對于某些生物大分子（如核酸和蛋白質(zhì)），可以根據(jù)他們在紫外光區(qū)的特征吸收峰波長（如核酸260nm，蛋白質(zhì)280nm）處測得吸光值，可通過求二者吸光值的比值來判斷純度。

1.3 凝膠色譜法

凝膠色譜也可用于多糖的純度鑒定——若經(jīng)凝膠色譜得到單一對稱峰，說明該多糖為均一組分。

2 實驗儀器和材料

儀器：電子天平、紫外-可見分光光度計、超聲波清洗器、電熱真空干燥箱、層析柱（3cm×100cm）、層析缸（7cm×25cm）。

試劑：葡聚糖凝膠、磷酸、正丁醇、丙酮、醋酸、氯化鈉、濃硫酸、苯酚、苯胺、鋅粉等（均為分析純試劑）。

原料：復(fù)方多糖樣品（已經(jīng)過離子交換樹脂初步分離）。

3 實驗方法

3.1 多糖的分離純化

3.1.1 裝柱、平衡

稱取葡聚糖干粉20.0g，在90℃蒸餾水中溶脹5h。溶脹平衡后，在凝膠顆粒面上加較多的水，用攪棒將凝膠攪勻，放置數(shù)分鐘，將沉降很慢的細顆粒隨上層水到掉，如此反復(fù)至上層沒有細顆粒為止。向洗好的凝膠中加入2倍凝膠體積的NaCl溶液，放置于80℃水中加熱30～40min以排除凝膠溶液中的氣泡，同時，另取200mL同濃度的NaCl溶液在80℃水中加熱以排除溶液中的氣泡，以備裝柱時用。

除完氣泡后，選長為100.0cm、外徑為3.0cm的層析柱開始裝柱。將除好氣泡的200mL NaCl溶液倒入柱中，再將已做好的薄棉花片鋪于柱底，把凝膠溶液攪勻倒進柱中，待柱底面上積起約1～2cm的凝膠床后，打開柱的出口，隨著下面水的流出上面不斷加入凝膠，并不斷輕敲四周柱壁，使形成的凝膠床面上有均勻連續(xù)的凝膠降下，得到均勻的凝膠柱。裝好凝膠柱后，量算出有效柱體積，用3～5倍柱體積的NaCl溶液平衡凝膠柱。

3.1.2 上樣、洗脫

取0.1g樣品溶于0.1mol?L-1的NaCl溶液中，使其體積為柱體積的0.5%，將凝膠柱層面上的洗脫液放出至距床面小于0.5mm時，用移液管將配制好的樣品溶液逐滴加在床面上，使樣品溶液均勻平鋪在凝膠床面上，待樣品溶液完全進入凝膠柱后，向床面上緩緩加上10cm高的洗脫液，再逐滴加入洗脫液進行洗脫，使加入洗脫液的速度與凝膠柱流速相等。

計算凝膠柱流速及每分鐘流出的體積，每流出3mL收集一次，至流出液呈無色為止，停止收集。再分別用0.2mol?L-1、0.3mol?L-1、0.4mol?L-1、0.5mol?L-1NaCl溶液重復(fù)進行上述實驗步驟。

3.1.3 洗脫劑濃度的選擇

分別取收集的各瓶樣品溶液0.1mL，再依次加入1.0mL 5%苯酚、0.9mL蒸餾水和5.0mL濃硫酸，放置20min顯色后，在490nm下測其吸光度，并繪制吸收曲線，根據(jù)吸收曲線選擇最佳的洗脫劑濃度（實驗結(jié)果見圖表1～5）。

3.2 純度鑒定

3.2.1 紫外光譜法

用電光天平稱取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.0201g，配制成100mL溶液。取配制好的多糖溶液3.5mL、蒸餾水3.5mL，用紫外-可見分光光度計在200～400nm范圍內(nèi)每10nm測一次吸光度（實驗結(jié)果見表6）。

3.2.2 凝膠色譜法

取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.1g溶于7mL 0.2mol?L-1NaCl溶 液 中， 上SephadexG-200層 析 柱(3.0×60cm)，用0.2mol?L-1NaCl溶液洗脫，流速為54s/滴，分步收集，每30min收集一次，至流出液呈無色為止，停止收集，用苯酚-硫酸法檢測（實驗結(jié)果見表7、圖6）。

3.2.3 紙層析法

稱取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.0502g，加入10mL蒸餾水配成0.5%多糖溶液，濾紙尺寸為(4cm×23cm)，以正丁醇：乙醇：水＝4:1:5為展開劑，室溫展開6h，苯胺磷酸鹽為顯色劑，100℃，顯色10min。

4. 實驗結(jié)果與討論

4.1 洗脫效果與討論

表1 0.1mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖1 0.1mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表2 0.2mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖2 0.2mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表3 0.3mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖3 0.3mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表4 0.4mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖4 0.4mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

表5 0.5mol?L-1NaCl溶液洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)表

圖5 0.5mol?L-1NaCl溶液洗脫曲線

由圖1、圖2、圖3、圖4、圖5可以看出，以0.2mol?L-1NaCl溶液為洗脫劑所得的曲線峰形及對稱性較好，因此可確定用葡聚糖凝膠分離復(fù)方免疫增強劑中多糖的最佳洗脫劑為0.2mol?L-1的NaCl溶液。

4.2 純度鑒定結(jié)果與討論

表6 紫外光譜實驗數(shù)據(jù)

圖6 凝膠色譜法純度鑒定洗脫曲線

4.2.1 紫外光譜法

由以上數(shù)據(jù)可以看出，在260nm和280nm處樣品無吸收峰，說明此多糖樣品中不含蛋白質(zhì)和核酸。

表7 凝膠色譜法純度鑒定實驗數(shù)據(jù)

4.2.2 凝膠色譜法

由以上數(shù)據(jù)和圖形可以看出，得到的曲線是單一對稱峰，說明此多糖樣品為均一組分。

4.2.3 紙層析

經(jīng)顯色烘干后可見濾紙上只有一個斑點，可說明此多糖樣品為均一組分。

5 結(jié)論

以0.2mol?L-1的NaCl溶液為洗脫劑，使用Sephadex G-200可有效分離純化復(fù)方免疫增強劑中多糖，達到最佳分離效果。

經(jīng)紫外光譜法、凝膠色譜法、紙層析法、旋光度法鑒定，由Sephadex G-200分離純化出的復(fù)方多糖為均一組分。